Synthesis and evaluation of radiolabeled synthetic somatostatin analogs in the in vivo localization of neoplasms

see the original item page
in the repository's web site and access all digital files if the item*

PhD thesis (EN)

2008 (EN)
Ανάπτυξη και αξιολόγηση ραδιοεπισημασμένων συνθετικών αναλόγων της σωματοστατίνης για την in vivo εντόπιση νεοπλασμάτων
Synthesis and evaluation of radiolabeled synthetic somatostatin analogs in the in vivo localization of neoplasms

Νικολοπούλου, Αναστασία Δ.

The overexpression of peptide receptors on the surface of a variety of cancer cell types constitutes the molecular basis for the in vivo targeting of neoplasms with radiolabeled peptides - radiopeptides. This approach has seen a spectacular growth with the development of radiolabeled SRIF (somatotropin-release inhibiting factor) analogs, such as octreotide and its derivatives, for the molecular targeting of sst2-positive tumors (sst2: somatostatin subtype 2 receptors). Today, [111In- DTPA0]octreotide (OctreoScan®) is the radiopharmaceutical of choice in the diagnostic imaging and staging of sst2-positive neuroendocrine tumors (e.g. carcinoids, gastrinomas, pheochromocytomas, paragaggliomas and insulinomas), with greater sensitivity and selectivity compared to conventional anatomical imaging techniques (e.g. US, CT, MRI). Despite its initial success, OctreoScan®’s broader application is hampered by using 111In (a cyclotron-produced radionuclide of high cost and sub-optimal nuclear characteristics, such as the emission of particle radiation). Contrary to 111In, 99mTc still remains the ideal diagnostic radionuclide of nuclear medicine given its nuclear properties (t½= 6.02 h, Eγ= 141 keV, absence of particle radiation) as well as important practical and financial advantages related to its availability mode (commercial 99Mo/99mTc generator). In view of this, the development of a specific sst2-seeking [99mTc]-radiotracer as an alternative to OctreoScan® for routine examinations in diagnostic oncology is highly attractive. In the present thesis, the synthesis and preclinical evaluation of two novel 99mTc-labeled SRIF analogs, [99mTc]Demotide ([99mTc-Ν40,Tyr3]octreotide) and [99mTc]Demotate ([99mTc-Ν40,Tyr3]octreotate), for potential application in the in vivo targeted diagnosis of sst2-positive neoplasms and their metastases is described. Demotide and Demotate derived from [DTPA0]octreotide by substitution of Phe3 by Tyr3 (Demotide, Demotate) and Thr(ol)8 by Thr8-ΟΗ (Demotate). Most importantly, instead of DTPA the acyclic tetraaamine derivative 6-{p-[(carboxymethoxy)acetyl]aminobenzyl}-1,4,8,11- tetraazaundecane (Ν4) has been attached at the Ν-terminal (D)Phe1 to allow for stable 99mTc binding. The presence of a diglycolic acid linker between the benzylamino group of Ν4 and the peptide backbone facilitated the peptide synthesis both in solution (Demotide) and on solid support (Demotate), enhanced their hydrophilicity and kept the Ν4 moiety away from the receptor recognition site. The two Ν4-modified peptides were isolated in high purity (>97%) and in good yields whereas ESI-MS spectrometry results were consistent with the expected formulae. The binding ability of Demotide and Demotate to the sst2 was high (IC50s in the sub-nM range), as revealed by competition binding assays in sst2-positive tissues (rat brain cortex membranes, rat acinar carcinoma AR4-2J cell membranes and rat acinar carcinoma CA20948 cells). Receptor autoradiography on freeze-dried sections of cell preparations stably expressing each of the hsst1-5 confirmed the selective binding of Demotate mainly to the hsst2. The hsst2 binding of Demotate was higher in comparison to SRIF-28 and much higher in comparison to [DTPA0]octreotide. Labeling of Demotide and Demotate with 99mTc was accomplished by incubation of peptide conjugates with 99mTcO4 - and SnCl2 in the presence of citrate anions for 30 min at RT (pH 11.5). Incorporation of 99mTc by the tetraamine unit was almost quantitative (>97%) and led to a single labeled product, [99mTc]Demotide or [99mTc]Demotate, in high purity and high specific activity (1 Ci/μmol). Radiopeptides were stable (>96%) for at least 6 h post labeling. Chromatographic comparison of [99mTc]Demotide and [99mTc]Demotate with the respective authentic ReV compounds, [ReV]Demotide and [ReV]Demotate, confirmed the formation of [99mTc(O)2(Ν4)]+-peptide analogs. As revealed by saturation binding experiments in AR4-2J cell membranes employing [99gTc/99mTc]Demotide and [99gTc/99mTc]Demotate, the incorporation of the radiometal and the presence of the [TcV(O)2(Ν4)]+ complex at the N-terminus of the two peptides did not negatively affect their binding ability to the sst2 (Kd= 0.08±0.02 nM and 0.07±0.01 nM, respectively). Furthermore, the two radiopeptides were rapidly internalized in high percentage (∼80%) during incubation with AR4-2J or CA20948 cells at 37oC, via a sst2 receptor-mediated process. [99mTc]Demotate showed a faster internalization rate compared to [99mTc]Demotide. In accordance with the in vitro results, [99mTc]Demotide and [99mTc]Demotate showed high and specific sst2 binding also in vivo, as revealed by biodistribution studies in healthy (Swiss albino mice, Wistar rats) and pathological animal models (Swiss nu/nu athymic mice bearing experimental AR4-2J tumors). Soon after their administration via the tail vein, [99mTc]Demotide and [99mTc]Demotate localized rapidly and in high percentage in the sst2-positive tissues, such as the pancreas, the adrenals, the stomach, the intestines, as well as the AR4-2J tumor. The uptake of [99mTc]Demotide and [99mTc]Demotate was sst2-specific and significantly higher compared to that of OctreoScan® (Ρ<0.001); the latter was included in the study as reference compound. The high hydrophilicity of the two radiopeptides resulted in rapid blood clearance and rapid excretion – and especially of [99mTc]Demotate (Thr8-ΟΗ instead of Thr(ol)8) - from background tissues mainly via the kidneys and the urinary tract. Similarly to [99mTc]-radiopeptides, OctreoScan® excreted rapidly from the body of the animals into the urine, showing nevertheless high and prolonged retention in the kidneys. Metabolic studies showed that [99mTc]Demotide and [99mTc]Demotate are stable in murine plasma and that are excreted in the urine in their initial form, without detectable traces of degradation products. The faster in vivo sst2-targeting and the more favorable pharmacokinetic behavior of [99mTc]Demotide/[99mTc]Demotate - and especially of [99mTc]Demotate – as compared to OctreoScan® led to higher target (AR4-2J tumor, pancreas, adrenals) to background (background tissues, excretory organs) ratios. Thus, 1 h after administration of [99mTc]Demotide/[99mTc]Demotate clear delineation of the sst2-positive AR4-2J tumors was evident with high contrast and high specificity. Μoreover, the images achieved with [99mTc]Demotate were of higher quality as compared to [99mTc]Demotide, due to the faster clearance of this more hydrophilic radiopeptide from background tissues. In conclusion, [99mTc]Demotide and [99mTc]Demotate satisfied important criteria and combined a variety of favorable properties for successful application in the targeted dagnostic imaging of sst2-positive tumors in man, such as favorable pharmacokinetics, metabolic stability as well as rapid and high in vivo sst2-targeting. It is worth mentioning that, the favorable in vivo profile – in else, the rapid acquisition of the highest target/“background” ratios – of [99mTc]Demotide/[99mTc]Demotate harmonizes well with the half-life of 99mTc (t½= 6.02 h). These characteristics provide the prospect to implement a logistically convenient one-day clinical protocol without compromising image quality. Such a protocol will facilitate the patient management in clinical practice in comparison to OctreoScan® (111In: t½= 67.2 h). The latter is more suitable for a two-day examination protocol according to the manufacturer’s suggestion.
Η υπερέκφραση πεπτιδικών υποδοχέων στην επιφάνεια διαφόρων τύπων καρκινικών κυττάρων αποτελεί τη μοριακή βάση για την in vivo στόχευση νεοπλασμάτων με ραδιοεπισημασμένα πεπτίδια - ραδιοπεπτίδια. Η προσέγγιση αυτή γνώρισε θεαματική πρόοδο με την ανάπτυξη ραδιοεπισημασμένων αναλόγων της SRIF (somatotropin-release inhibiting factor), όπως το octreotide ή παράγωγά του, για την μοριακή στόχευση όγκων που υπερεκφράζουν τους sst2 (somatostatin subtype 2 receptors). Σήμερα, το [111In-DTPA0]octreotide (OctreoScan®) αποτελεί το ραδιοφάρμακο επιλογής στην απεικονιστική διάγνωση και σταδιοποίηση sst2-θετικών νευροενδοκρινικών όγκων (π.χ. καρκινοειδών, γαστρινωμάτων, φαιοχρωμοκυτωμάτων, παραγαγγλιωμάτων και ινσουλινωμάτων) με ευαισθησία και εξειδίκευση μεγαλύτερη από άλλες ανατομικές απεικονιστικές τεχνικές (US, CT, MRI). Παρά την αρχική του επιτυχία, η ευρύτερη εφαρμογή του OctreoScan® περιορίζεται λόγω του 111In (ραδιονουκλίδιο κυκλοτρονίου με υψηλό κόστος και μη ιδανικές πυρηνικές ιδιότητες, όπως εκπομπή σωματιδιακής ακτινοβολίας). Σε αντίθεση με το 111In, το 99mTc παραμένει το ιδανικό διαγνωστικό ραδιονουκλίδιο της πυρηνικής ιατρικής λόγω των πυρηνικών του ιδιοτήτων (t½= 6.02 h, Eγ= 141 keV, απουσία σωματιδιακής ακτινοβολίας) καθώς και σημαντικών πρακτικών και οικονομικών πλεονεκτημάτων που σχετίζονται με τον τρόπο διάθεσής του (εμπορική γεννήτρια 99Mo/99mTc). Επομένως, η ανάπτυξη ενός [99mTc]-ραδιοϊχνηθέτη ειδικού για την in vivo στόχευση sst2-θετικών όγκων και εναλλακτικού του OctreoScan® για εξετάσεις της διαγνωστικής ογκολογίας είναι ιδιαίτερα ελκυστική. Στην παρούσα διατριβή περιγράφεται η σύνθεση και η προκλινική αξιολόγηση δύο νέων αναλόγων της SRIF επισημασμένων με 99mTc, [99mTc]Demotide ([99mTc-Ν40,Tyr3]octreotide) και [99mTc]Demotate ([99mTc-Ν40,Tyr3]octreotate), για εφαρμογή στην στοχευμένη διάγνωση sst2-θετικών νεοπλασμάτων και των μεταστάσεών τους. Τα Demotide και Demotate προέκυψαν από το [DTPA0]octreotide με αντικατάσταση της Phe3 από Tyr3 (Demotide, Demotate) και της Thr(ol)8 από Thr8-ΟΗ (Demotate). Κατά κύριο όμως λόγο, στο Ν-τελικό αμινοξύ (D)Phe1, αντί του DTPA, προσδέθηκε παράγωγο άκυκλης τετρααμίνης(6-{π-[(καρβοξυμεθοξυ)ακετυλο]αμινοβενζυλο}-1,4,8,11 τετρααζαενδεκάνιο (Ν4)) για την σταθερή δέσμευση του 99mTc. Η παρουσία ενός συνδετικού μορίου διγλυκολικού οξέος μεταξύ της βενζυλαμινομάδας του Ν4 και του πεπτιδικού τμήματος διευκόλυνε τη σύνθεση των πεπτιδίων τόσο σε διάλυμα (Demotide) όσο και σε στερεή φάση (Demotate), ενίσχυσε την υδροφιλικότητά τους και διατήρησε το Ν4 μακριά από την θέση αναγνώρισης του υποδοχέα. Τα δύο Ν4-τροποποιημένα πεπτίδια παραλήφθηκαν σε υψηλή καθαρότητα (>97%) και σε ικανοποιητική απόδοση, ενώ φασματομετρία ESI-MS ήταν σε συμφωνία με τις αναμενόμενες δομές. Η ικανότητα δέσμευσης των Demotide και Demotate στον sst2 ήταν υψηλή (IC50s στην υπό-nM περιοχή) όπως αποδείχτηκε με πειράματα ανταγωνιστικής δέσμευσης σε sst2-θετικούς ιστούς (μεμβράνες φλοιού εγκεφάλου επίμυα, μεμβράνες καρκινικών κυττάρων AR4-2J και καρκινικά κύτταρα CA20948). Αυτοραδιογραφία υποδοχέων σε τομές παρασκευασμάτων κυττάρων που εκφράζουν επιλεκτικά έναν από τους hsst1-5 επιβεβαίωσε την δέσμευση του Demotate κυρίως στον hsst2, με συγγένεια μάλιστα υψηλότερη της SRIF-28 και πολύ υψηλότερη του [DTPA0]octreotide. Η επισήμανση των Demotide και Demotate με 99mTc πραγματοποιήθηκε υπό ήπιες συνθήκες, με επώασή τους με 99mTcO4 - και SnCl2 παρουσία κιτρικών ιόντων για 30 min σε RT (pH11.5). Η ενσωμάτωση του 99mTc στον τετρααμινικό υποκαταστάτη ήταν σχεδόν ποσοτική (>97%) και οδήγησε σε ένα επισημασμένο προϊόν, [99mTc]Demotide ή [99mTc]Demotate, υψηλής καθαρότητας και υψηλής ειδικής ραδιενέργειας (1 Ci/μmol). Τα ραδιοπεπτίδια ήταν σταθερά (>96%) για τουλάχιστον 6 h μετά την επισήμανση. Χρωματογραφική σύγκριση των [99mTc]Demotide και [99mTc]Demotate με τις αντίστοιχες ενώσεις με μεταλλικό ρήνιο (ReV), [ReV]Demotide και [ReV]Demotate, επιβεβαίωσε τον σχηματισμό [99mTc(O)2(Ν4)]+-πεπτιδικών αναλόγων. Όπως αποδείχτηκε με πειράματα δέσμευσης κορεσμού σε μεμβράνες κυττάρων AR4-2J για τα [99gTc/99mTc]Demotide και [99gTc/99mTc]Demotate, η ενσωμάτωση του ραδιομετάλλου και η παρουσία του συμπλόκου [TcV(O)2(Ν4)]+ στο Ν-τελικό άκρο των δύο πεπτιδίων δεν επηρέασε αρνητικά την ικανότητα δέσμευσής τους στον sst2 (Kd= 0.08±0.02 nM και 0.07±0.01 nM, αντίστοιχα). Επιπλέον, τα δύο ραδιοπεπτίδια εσωτερικεύτηκαν γρήγορα και σε υψηλό ποσοστό (∼80%) κατά την επώασή τους με κύτταρα AR4-2J και CA20948 στους 37oC, με την διαμεσολάβηση των sst2. Σε κάθε περίπτωση, το [99mTc]Demotate έδειξε ταχύτερο ρυθμό εσωτερίκευσης συγκριτικά με το [99mTc]Demotide. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα in vitro, τα [99mTc]Demotide και [99mTc]Demotate έδειξαν υψηλή και εξειδικευμένη ικανότητα δέσμευσης στους sst2 επίσης in vivo, όπως καταδείχθηκε με μελέτες βιοκατανομής σε υγιή (ποντίκια Swiss albino, επίμυες Wistar) και παθολογικά πρότυπα πειραματοζώων (άθυμα ποντίκια Swiss nu/nu με πειραματικούς όγκους AR4-2J). Αμέσως μετά την χορήγησή τους από την φλέβα της ουράς, τα [99mTc]Demotide και [99mTc]Demotate εντοπίστηκαν γρήγορα και σε υψηλό ποσοστό σε sst2-θετικούς ιστούς, όπως το πάγκρεας, τα επινεφρίδια, τον στόμαχο, το έντερο αλλά και στον όγκο AR4-2J. Σε κάθε περίπτωση, η πρόσληψη ήταν sst2-ειδική και σημαντικά υψηλότερη από την αντίστοιχη του OctreoScan® (Ρ<0.001), το οποίο συμπεριελήφθηκε στην μελέτη ως ένωση αναφοράς. Η υψηλή υδροφιλικότητα των ραδιοπεπτιδίων οδήγησε σε ταχεία αιματική κάθαρση και ταχεία απέκκριση/απομάκρυνσή τους – και ειδικότερα του [99mTc]Demotate (Thr8-ΟΗ αντί Thr(ol)8) - από τους παρακείμενους ιστούς κυρίως διαμέσου των νεφρών και του ουροποιητικού συστήματος. Παρόμοια με τα 99mTc-ραδιοπεπτίδια, το OctreoScan® απομακρύνθηκε γρήγορα από το σώμα των πειραματοζώων στα ούρα επιδεικνύοντας όμως υψηλή και παρατεταμένη κατακράτηση στους νεφρούς. Μελέτες μεταβολισμού έδειξαν ότι τα [99mTc]Demotide και [99mTc]Demotate είναι σταθερά στο πλάσμα αίματος ποντικιού και ότι απεκκρίνονται στα ούρα με την αρχική τους μορφή, χωρίς ανιχνεύσιμα ίχνη προϊόντων αποικοδόμησης. Η ταχύτερη in vivo sst2-στόχευση και η ευνοϊκότερη βιοκινητική συμπεριφορά των [99mTc]Demotide/[99mTc]Demotate - και ειδικότερα του [99mTc]Demotate - έναντι του OctreoScan®, οδήγησε σε υψηλότερους λόγους ραδιενέργειας στόχου (π.χ. όγκος AR4-2J, πάγκρεας, επινεφρίδια) προς ραδιενέργεια “υποστρώματος” (παρακείμενοι ιστοί, όργανα απέκκρισης). Έτσι, 1 h μετά την χορήγηση των [99mTc]Demotide/[99mTc]Demotate οι sst2-θετικοί όγκοι AR4-2J απεικονίστηκαν με μεγάλη ευκρίνεια και εξειδίκευση. Μάλιστα, οι απεικονίσεις ήταν υψηλότερης ποιότητας στην περίπτωση του [99mTc]Demotate λόγω ταχύτερης απομάκρυνσης του πιο υδρόφιλου αυτού ραδιοπεπτιδίου από τους παρακείμενους ιστούς σε σχέση με το [99mTc]Demotide. Συμπερασματικά, τα [99mTc]Demotide και [99mTc]Demotate ικανοποίησαν και συνδύασαν σημαντικά κριτήρια για επιτυχή εφαρμογή στην στοχευμένη απεικονιστική διάγνωση sst2-θετικών όγκων στον άνθρωπο, όπως ευνοϊκή βιοκινητική, μεταβολική σταθερότητα και ταχεία και υψηλή ικανότητα in vivo στόχευσης των sst2. Αξιοσημείωτο είναι ότι, η ευνοϊκή βιοκινητική - δηλαδή η ταχεία επίτευξη των ύψιστων τιμών στόχου/“υπόστρωμα” - των [99mTc]Demotide/[99mTc]Demotate εναρμονίζεται με την ημιπερίοδο ζωής του 99mTc (t½= 6.02 h). Αυτό αναμένεται να επιτρέψει την εφαρμογή διαγνωστικού κλινικού πρωτοκόλλου μίας ημέρας χωρίς να “θυσιάζεται” η ποιότητα της απεικόνισης. Με αυτό τον τρόπο διευκολύνεται η διαχείριση των ασθενών στην κλινική πράξη σε σύγκριση με το OctreoScan® (111In: t½= 67.2 h), το οποίο είναι περισσότερο κατάλληλο για πρωτόκολλο δύο ημερών, όπως συνιστάται άλλωστε για την επιτυχέστερη κλινική του εφαρμογή.

PhD Thesis / Διδακτορική Διατριβή

Tumor diagnostic imaging
Πεπτίδια, Σύνθεση
Peptides, Synthesis
Πεπτιδικά ανάλογα
99(m) Tc Labeling
Peptide analogs
Μοριακή στόχευση
Molecular Targeting
Διαγνωστική απεικόνιση όγκων

Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης (EL)
Aristotle University of Thessaloniki (EN)



Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης, Σχολή Επιστημών Υγείας, Τμήμα Φαρμακευτικής

This record is part of 'IKEE', the Institutional Repository of Aristotle University of Thessaloniki's Library and Information Centre found at Unless otherwise stated above, the record metadata were created by and belong to Aristotle University of Thessaloniki Library, Greece and are made available to the public under Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International license ( Unless otherwise stated in the record, the content and copyright of files and fulltext documents belong to their respective authors. Out-of-copyright content that was digitized, converted, processed, modified, etc by AUTh Library, is made available to the public under Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International license ( You are kindly requested to make a reference to AUTh Library and the URL of the record containing the resource whenever you make use of this material.

*Institutions are responsible for keeping their URLs functional (digital file, item page in repository site)