Developemnt and study of haemocompatible and antimicrobial materials

 
see the original item page
in the repository's web site and access all digital files if the item*
share



PhD thesis (EN)

2009 (EN)
Ανάπτυξη και μελέτη αιμοσυμβατών και αντιμικροβιακών υλικών
Developemnt and study of haemocompatible and antimicrobial materials

Λουσινιάν, Συλβί Λ.

Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε το φαινόμενο της προσρόφησης βασικών πρωτεϊνών του πλάσματος του αίματος σε λεπτά υμένια άμορφου υδρογονωμένου άνθρακα (a-C:H), άμορφου νιτριδίου του βορίου (a-BN) και διβοριδίου του τιτανίου (TiB2). Αναπτύχθηκαν πολυμερικά υμένια που περιέχουν νανοσωματίδια οξειδίου του ψευδαργύρου (ZnO) και μελετήθηκε η δράση τους έναντι της προσκόλλησης βακτηρίων του είδους Staphylococcus aureus. Επίσης, μελετήθηκε η αντιβακτηριδιακή δράση των υμενίων a-C:H και TiB2. Η μελέτη των οπτικών ιδιοτήτων των υμενίων και των προσροφημένων πρωτεϊνών, καθώς και η μελέτη της πρωτεϊνικής προσρόφησης σε πραγματικό χρόνο, έγιναν με την τεχνική της Φασματοσκοπικής Ελλειψομετρίας (ΦΕ). Η επιφανειακή τοπογραφία των υμενίων και των προσροφημένων πρωτεϊνών μελετήθηκε με την τεχνική της Μικροσκοπίας Ατομικών Δυνάμεων (AFM). Για τη μελέτη της κατανομής του επιφανειακού ηλεκτρικού φορτίου και της υδροφιλικότητας των υμενίων χρησιμοποιήθηκαν οι τεχνικές της Μικροσκοπίας Ηλεκτρικών Δυνάμεων (ΕFM) και μετρήσεις γωνίας επαφής (Contact angle, CA). Τα κύρια αποτελέσματα της διατριβής μπορούν να συνοψιστούν ως ακολούθως: Αρχικά, για την περίπτωση της αρχικής εκτίμησης αιμοσυμβατότητας μέσω της παρατήρησης της προσρόφησης αλβουμίνης (HSA) και ινωδογόνου (Fib), έγινε συσχέτιση των ιδιοτήτων των υμενίων προς μελέτη με το λόγο προσρόφησης αλβουμίνης / ινωδογόνο (ΓHSA / ΓFib). Στα υμένια a- C:H πρωταρχικό ρόλο παίζει η τραχύτητα των υμενίων, καθώς τα περισσότερο τραχιά δείγματα ευνοούν την προσρόφηση της HSΑ (η επιφανειακή τους τραχύτητα είναι συγκρίσιμη με το μέγεθος του πρωτεϊνικού μορίου της) και συνεπώς παρουσιάζουν τη μεγαλύτερη τιμή ΓHSA / ΓFib. Οι τιμές του λόγου ΓHSA / ΓFib για τα υμένια που περιέχουν βόριο (a-BN και TiB2) είναι υψηλότερες σε σύγκριση με αυτές των υμενίων a-C:H. Οι επιφανειακές ιδιότητες των υμενίων είναι κυρίως εκείνες που καθορίζουν την πρωτεϊνική προσρόφηση. Τα υμένια a-BN που περιέχουν το περισσότερο βόριο στην επιφάνεια (τα λιγότερο ηλεκτραρνητικά), που είναι και τα περισσότερο υδρόφιλα, φαίνεται να έλκουν λιγότερο το ινωδογόνο και να μην ευνοούν την προσρόφησή του. Στα υμένια TiB2 που περιέχουν περισσότερο Β στην επιφάνειά τους (τα περισσότερο ηλεκτραρνητικά) παρουσιάζουν τη μεγαλύτερη τιμή λόγου u960 προσρόφησης αλβουμίνης / ινωδογόνου. Οι οπτικές ιδιότητες των δύο πρωτεϊνών είναι παρόμοιες. Τόσο η αλβουμίνη όσο και το ινωδογόνο είναι διαφανείς μέχρι τα 4eV περίπου και η πρωτεΐνη HSA παρουσιάζει λίγο μεγαλύτερη τιμή δείκτη διάθλασης (n(ω=0eV)=1.43) σε σχέση με αυτήν του δείκτη διάθλασης του Fib (n(ω=0eV)=1.40). Η ενέργεια μέγιστης απορρόφησης και των δύο πρωτεϊνών είναι περίπου 7.0 eV και οφείλεται κυρίως στους πεπτιδικούς δεσμούς. Από τις εικόνες τοπογραφίας AFM φαίνεται ότι το προσροφημένο ινωδογόνο είτε διατηρεί το χαρακτηριστικό του σχήμα με τις τρεις σφαιρικές περιοχές, είτε παίρνει ωοειδή μορφή, ενώ μπορεί να έχει ευθεία διαμόρφωση, να κάμπτεται, και πολλές φορές τα μόρια είναι ενωμένα μεταξύ τους. Οι μηχανισμοί προσρόφησης του ινωδογόνου σε λεπτά υμένια a-C:H διερευνήθηκαν σε πραγματικό χρόνο με την τεχνική της ΦΕ, σε pH 7.4 και στο ισοηλεκτρικό του σημείο (pI 5.8). Το ελλειψομετρικό μοντέλο που αναπτύχθηκε περιγράφει λεπτομερώς το φαινόμενο της πρωτεϊνικής προσρόφησης, με πληροφορίες σχετικά με το πάχος της σχηματιζόμενης στιβάδας του ινωδογόνου και σχετικά με τη μετατροπή της πρωτεΐνης από τη μορφή διαλύματος στην προσροφημένη της μορφή. Η τιμή του ενεργειακού χάσματος (Eg) που έχει το προσροφημένο ινωδογόνο είναι δείκτης της αφυδάτωσης του μορίου του, και είναι μεγαλύτερη στο πιο υδρόφοβο λεπτό υμένιο a-C:H, που δείχνει ότι σε αυτό το προσροφημένο ινωδογόνο είναι πιο αφυδατωμένο. Η μέγιστη οπτική απορρόφηση (Eo) του ινωδογόνου στο φυσιολογικό pH 7.4 (5.55eV και 6.73eV) και οφείλεται στους πεπτιδικούς δεσμούς και στη δευτεροταγή δομή του ινωδογόνου. Στο ισοηλεκτρικό σημείο pI 5.8 η συνεισφορά της δευτεροταγούς διαμόρφωσης εξαφανίζεται και παραμένει μόνο η συνεισφορά των πλευρικών αρωματικών ομάδων των αμινοξικών υπολοίπων, μετατοπίζοντας την ενέργεια Eo σε μικρότερες τιμές. Οι τιμές πάχους και ποσοστού όγκου του προσροφημένου ινωδογόνου επηρεάζονται σε μεγάλο βαθμό από την επιφανειακή τοπογραφία (νανοδομές) και την υδροφοβικότητα των λεπτών υμενίων a-C:H που μελετήθηκαν. Στο υμένιο με πολύ μικρές επιφανειακές νανοδομές δεν διευκολύνεται η πρόσδεση του ινωδογόνου. Επίσης, η υδροφοβικότητά του αναγκάζει το μόριο του ινωδογόνου να αλλάζει διαμόρφωση, ώστε οι υδρόφιλες ομάδες του να μετακινούνται προς το εσωτερικό του και οι υδρόφοβες να εκτίθενται προς την επιφάνεια του υμενίου. Για το λόγο αυτόν, οι τιμές πάχους και ποσοστού όγκου του προσροφημένου ινωδογόνου παρουσιάζουν διακυμάνσεις ενδεικτικές των αλλαγών στη διαμόρφωση των μορίων του ινωδογόνου κατά τη διάρκεια της προσρόφησης. Αντίθετα, για το πιο υδρόφιλο υμένιο με μεγαλύτερες επιφανειακές νανοδομές, παρατηρείται σταθερή αύξηση στις τιμές πάχους και ποσοστού όγκου του προσροφημένου ινωδογόνου. Τα πειραματικά δεδομένα από τη ΦΕ σε συνδυασμό με τη χρήση κατάλληλου μοντέλου κινητικής αποκάλυψαν ότι το συνολικό φαινόμενο της πρωτεϊνικής προσρόφησης του ινωδογόνου πάνω στα υμένια a-C:H λαμβάνει χώρα σε δύο στάδια: ένα ταχύτατο πρώτο στάδιο, όπου λαμβάνει χώρα η προσρόφηση του μεγαλύτερου μέρους της ποσότητας της πρωτεΐνης, κι ένα δεύτερο βραδύτερο. Δύο πιθανά αίτια προτείνονται για την εμφάνιση δύο σταδίων στο φαινόμενο της προσρόφησης του ινωδογόνου πάνω στα υμένια a-C:H. Αυτά αφορούν στον απαραίτητο για τα πρωτεϊνικά μόρια χρόνο εφησυχασμού ανάμεσα στα δύο στάδια, για την απόκτηση κατάλληλου προσανατολισμού και διαμόρφωσης των μορίων u953 ινωδογόνου πάνω στην επιφάνεια, και στην επίδραση των διαφορετικών τοπικών επιφανειακών φορτίων των υμενίων που μελετήθηκαν που έλκουν διαφορετικές περιοχές του μορίου του ινωδογόνου και με διαφορετικό ρυθμό πρόσδεσης. Όσον αφορά τη μελέτη των αντιβακτηριδιακών ιδιοτήτων υμενίων a-C:H και TiB2, έναντι του βακτηρίου Staphylococcus aureus, αυτά ευνοούν την προσκόλλησή του σε σύγκριση με το c-Si, αλλά τα υμένια a-C:H και TiB2 που βρέθηκαν να έχουν μεγαλύτερες τιμές λόγου ΓHSA / ΓFib ευνοούν λιγότερο την προσκόλληση των βακτηρίων. Τέλος, παρασκευάστηκαν νανοσωματίδια (NPs) οξειδίου του ψευδαργύρου (ZnO) σε θερμοκρασίες 23°C (με σύσταση ZnO και Zn(OH)2 και μέγεθος 20-30nm), 70°C (σύσταση ZnO, μέγεθος 15- 17nm) και 90°C (σύσταση ZnO, μέγεθος 25-30nm) και αναπτύχθηκαν πολυμερικά υμένια που περιέχουν ZnO NPs σε τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις . Το μέγεθος των NPs παίζει ρόλο στις μικρές συγκεντρώσεις των NPs στα υμένια που αναπτύχθηκαν, λόγω του αυξημένου λόγου επιφάνειας-όγκου, που οδηγεί σε αυξημένη παραγωγή Η2Ο2, το οποίο διαπερνά την κυτταρική μεμβράνη και παρεμποδίζει την ανάπτυξη και την επιβίωση των βακτηρίων. Σε μεγάλη συγκέντρωση NPs όλα τα υμένια που τα περιέχουν παρουσιάζουν μεγαλύτερη αντιβακτηριδιακή δραστηριότητα σε σύγκριση με αυτήν που έχει μόνο το πολυμερικό υμένιο
During this research thesis, protein adsorption phenomenon of basic blood plasma proteins on amorphous hydrogenated carbon (a-C:H), amorphous boron nitride (a-BN) and titanium diboride (TiB2) thin films was studied. Polymeric films contanting zinc oxide (ZnO) nanoparticles were developed and their antibacterial properties against the species Staphylococcus aureus was investigated. The antibacterial properties of a-C:H and TiB2 was also studied. Spectroscopic Ellipsometry (SE) was implemented for the study of the optical properties of the thin films and the adsorbed proteins, as well as for the real-time monitoring of protein adsorption. The surface topography and the thin films and the adsorbed proteins was studied by Atomic Force Microscopy (AFM) technique. Electric Force Microscopy (EFM) and Contact angle (CA) techniques were used for the study of surface electric charge distribution and of the wettability properties. The main results of this research thesis are resumed below: In the case of a preliminary assessment of the haemocompatibility of the thin films through the study of the adsorption of human serum albumin (HSA) and fibrinogen (Fib), the properties of the thin films were correlated with the ratio of HSA / Fib adsorption (ΓHSA / ΓFib). The surface roughness of a-C:H thin films plays a crucial role, since the rougher samples favour the adsorption of HSA (their surface roughness is comparable to the HSA molecule size); thus, they present higher ΓHSA / ΓFib value. The ΓHSA / ΓFib values concerning boron-containing thin films (a-BN and TiB2) are higher than these of a-C:H films. Their surface properties are important for the protein adsorption evolution. a-BN thin films containing more boron on their surface (less negatively charged surface) are also the most hydrophilic, and attract less the fibrinogen molecules, not favouring their adsorption. For the TiB2 films, those containing more boron on their surface (more negatively charged surface) exhibit the higher ΓHSA / ΓFib values. The two proteins present similar optical properties. Both HSA and Fib are transparent until about 4eV, and albumin presents a slightly higher value of the refractive index (n(ω=0eV)=1.43) that Fib’s (n(ω=0eV)=1.40). The energy of maximum optical absorption is around 7eV, mainly due the peptide bonds. AFM topography images show that the adsorbed fibrinogen can either preserve its characteristic trinodular shape or have an oval shape. It can also have a linear or curved conformation, while many times the molecules seem to be conjunct. The adsorption mechanisms of fibrinogen on a-C:H thin films were studied in real-time by the use of SE technique, for pH 7.4 and Fib’s isoelectric point pI 5.8. The developed ellipsometric model described in detail the protein adsorption phenomenon, providing information about the protein layer thickness and the transformation of the protein molecules from the solution form to the adsorbed form. The fundamental gap value (Eg) of the adsorbed fibrinogen indicates the molecules’ dehydration. Eg is higher for the more hydrophobic a-C:H film, revealing that Fib is more dehydrated when adsorbed on it. The maximum optical absorption is exhibited at 5.55eV and 6.73eV for pH 7.4, and is due to the peptide bonds and the secondary structure of the protein. At pI 5.8, the contribution of the secondary structure no longer exists, while the contribution of aromatic side chains remains, thus shifting the energy Eo of maximum optical absorption at lower values. The thickness and volume fraction of adsorbed fibrinogen are affected by the surface topography (nanostructure) and the wetting properties of the studied a-C:H thin films. The Fib adsorption is not favoured on the film with small nanostructures. Also, its hydrophobicity compels the Fib molecule to change conformation, with its hydrophilic groups in the interior of the molecule and its hydrophobic groups exposed to the surface of the thin film. This is the reason for the change / fluctuation of the thickness values and the volume fraction of the adsorbed Fib during its adsorption. On the other hand, a constant increase of these values is observed on the more hydrophilic film with larger surface nanostructures. SE experimental results combined with an appropriate theoretical kinetic model revealed that the total fibrinogen adsorption phenomenon on the studied a-C:H films takes place in two stages: a fast first stage, where most of the protein is adsorbed on the surface, and a second slower stage. There are two proposed reasons for the existence of these two stages. These concern the relaxation time that is necessary for the Fib molecules, in order to find the orientation and conformation that allow other molecules to adsorb on the rest of the surface that is available; and the effect of locally charged areas on the surface of the thin films, that attract different domains of the Fib molecules with different adsorption rate. As far as the antibacterial properties of the films is concerned, a-C:H and TiB2 favour the S.aureus adhesion compared to silicon. However, the a-C:H and TiB2 which present higher ΓHSA / ΓFib value favour less the S.aureus adhesion. Finally, zinc oxide nanoparticles (ZnO NPs) were developed under three different temperatures: 23°C (composed by ZnO και Zn(OH)2 ,size 20-30nm), 70°C (composed by ZnO, size 15-17nm) και 90°C (composed by ZnO, size 25-30nm) and polymeric films containing ZnO NPs in three different concentrations were developed. The NPs size plays an important role for the low concentrations, due to the increased surface to volume ratio, which results is increased production of H2O2. This penetrates the bacteria cell membrane and inhibits their growth and their survival. For high NPs concentrations, all the films containing ZnO NPs exhibit good antibacterial properties against S.aureus

PhD Thesis / Διδακτορική Διατριβή
info:eu-repo/semantics/doctoralThesis

Λεπτές ταινίες
Φασματοσκοπική ελλειψομετρία
Spectroscopic ellipsometry
Βιοϋλικά
Νανοτεχνολογία
Βιοϊατρικά υλικά
Πρωτεϊνες
Biomaterials
Thin films
Proteins
Biomedical materials
Αιμοσυμβατότητα
Haemocompatibility
Βακτήρια
Bacteria
Nanotechnology

Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης (EL)
Aristotle University of Thessaloniki (EN)

2009
2009-09-28T09:00:31Z


Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης, Σχολή Θετικών Επιστημών, Τμήμα Φυσικής

This record is part of 'IKEE', the Institutional Repository of Aristotle University of Thessaloniki's Library and Information Centre found at http://ikee.lib.auth.gr. Unless otherwise stated above, the record metadata were created by and belong to Aristotle University of Thessaloniki Library, Greece and are made available to the public under Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International license (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0). Unless otherwise stated in the record, the content and copyright of files and fulltext documents belong to their respective authors. Out-of-copyright content that was digitized, converted, processed, modified, etc by AUTh Library, is made available to the public under Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International license (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0). You are kindly requested to make a reference to AUTh Library and the URL of the record containing the resource whenever you make use of this material.
info:eu-repo/semantics/openAccess



*Institutions are responsible for keeping their URLs functional (digital file, item page in repository site)