H Mannheìmia haemolytica αποτελεί ένα από τα σημαντικότερα αίτια πνευμονίας στα μηρυκαστικά. Εξαιτίας των σοβαρών οικονομικών επιπτώσεων που προκαλεί, διάφορες μέθοδοι έχουν χρησιμοποιηθεί με στόχο τη επιζωοτιολογική μελέτη και τη μελέτη της παθογένειας του βακτηρίου, Σκοπός της παρούσας έρευνας ήταν η διερεύνηση της συχνότητας απομόνωσης των διαφόρων οροτύπων της Mannheìmia haemolytica στην Ελλάδα και η γενετική ανάλυση ενός σημαντικού γονιδίου λοιμοτοξικότητας του βακτηρίου, του γονιδίου ompAt Για το σκοπό αυτό, μελετήθηκαν ενενήντα τέσσερα στελέχη Μ, haemolytica που απομονώθηκαν από τεμάχια πνευμονικού ιστού ενός βοοειδούς, προβάτων και αιγών με μακροσκοπικές αλλοιώσεις πνευμονίας. Η ταυτοποίηση των στελεχών έγινε με βασικές βιοχημικές δοκιμές, καθώς και με τη μέθοδο της Πολλαπλής Αλυσιδωτής Αντίδρασης της Πολυμεράσης (Multiplex PCR), 11 οροτυποποίηση των στελεχών έγινε με τη μέθοδο της έμμεσης αιμοσυγκόλλησης. Για την μελέτη των πολυμορφισμών τ ου γονιδίου ompA, χρησιμοποιήθηκαν δύο μέθοδοι: η μέθοδος της Ιΐλ^κτροφόρησης Ιΐηκτής με ΔιαβαΟμισμένη Λποδιατακτική Σύσταση (ÜGGH-Dcnaturing Gradient Gel Blectrophoresis) και η ανάλυση της αλληλουχίας του γονιδίου (DNA sequencing). Ανάμεσα στα ενενήντα τέσσερα στελέχη, βρέθηκαν οι ορύτυποι Α15 Α2, Α5, Α6, Α7, Α9 και Α12. Ο ορότυπος Α2 ήταν ο επικρατέστερος. Το μοναδικό στέλεχος που απομονώθηκαν από βοοειδές ήταν Α2, όπως και τα στελέχη από αίγες. Τα υπόλοιπα στελέχη Α2 προήλθαν από πρόβατα. Η ανάπτυξη και εφαρμογή της μεθόδου DGGE αποκάλυψε πέντε διαφορετικά πρότυπα μεταξύ των στελεχών. Τα στελέχη πρόβειας προέλευσης, εμφάνισαν μεγαλύτερη παραλλακτικότητα (τέσσερα διαφορετικά πρότυπα), από αυτά που προέρχονταν από αίγες (δύο διαφορετικά πρότυπα). Το πρότυπο 2 ήταν το πιο διαδεδομένο και ακολουθούσαν τα πρότυπα Ι και 3, Το σύνολο των στελεχών που απομονώθηκαν από αίγες ανήκε σε δύο από αυτά τα πρότυπα, Η μέθοδος της ανάλυσης των αλληλουχιών του DNA εφαρμόστηκε με στόχο την επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων της DGGE και την εύρεση των συγκεκριμένων πολυμορφισμών. Η μελέτη του γονιδίου ompA ανέδειξε 11 διαφορετικούς γονότυπους μεταξύ των στελεχών της Μ, haemolytica, που χωρίστηκαν σε εννέα συνολικά ομάδες, Τα στελέχη των προβάτων έδειξαν μεγαλύτερη ετερογένειακαι κατατάχθηκαν σε οκτώ ομάδες, δύο από τις οποίες ήταν οι πολυπληθέστερες. Η πλειοψηφία των στελεχών που απομονώθηκαν από αίγες ανήκε στην ομάδα IX, η οποία συνέπιπτε με το πρότυπο 1 της DGGE. Η μελέτη της δευτεροταγούς δομής της πρωτεΐνης OmpA εντόπισε τις αντικαταστάσεις αμινοξέων στους επιφανειακούς βρόχους της πρωτεΐνης και, πιο συγκεκριμένα, στις υπερμεταβλητές περιοχές. Καθώς, για πρώτη φορά διεθνώς, αναφέρονται πολυμορφισμοί του γονιδίου ompA στελεχών της Μ. haemolytica τα οποία έχουν απομονωθεί από αίγες, τα στοιχεία της έρευνας συμβάλλουν στη μελέτη της εξελικτικής πορείας του γονιδίου, και στην αποσαφήνιση της ύπαρξης ή μη ειδικότητας των διαφόρων υπο-ομάδων ως προς τον ξενιστή.
(EL)
Pneumonia caused by Mannheìmia haemolytica is an important disease of ruminants. Because of its economic significance, several methods have been used to study the pathogenicity and epidemiology of M. haemolytica. The objectives of this study were to provide data about the prevalence of the different serotypes of the bacterium and to investigate the genetic diversity of a significant virulence factor, the ompA gene. Two methods, DNA sequencing analysis and DGGli, were used to study the polymorphisms of the ompA gene. Ninety-four isolates from pneumonic lungs were investigated. Capsular scrotyping showed that serotype Λ2 was the predominant serotype among ovine strains and the only serotype found in caprine strains. This is the first reported analysis of the ompA gene of M haemolytica strains isolated from goats. Analysis of the gene revealed five DGGli patterns and nine genotypic groups. The ovine isolates, which belonged to four DC G li patterns, showed a much greater diversity than the caprine strains, which belonged to just two DGGF patterns, Sequence analysis was used to verify the DGGE results and revealed eight genotypic groups among the ovine isolates and three among the caprine ones. Furthermore, the correlation of these results showed a great diversity of the ompA gene among serotype A2 isolates.
(EN)
