Technology of gene silencing. Histrory data, principle of methods and applications. Training seminars.

 
δείτε την πρωτότυπη σελίδα τεκμηρίου
στον ιστότοπο του αποθετηρίου του φορέα για περισσότερες πληροφορίες και για να δείτε όλα τα ψηφιακά αρχεία του τεκμηρίου*
κοινοποιήστε το τεκμήριο




2018 (EL)
Τεχνολογίες αποσιώπησης της έκφρασης γονιδίων. Ιστορικά δεδομένα, αρχή μεθόδων και εφαρμογές. Εκλαϊκευμένα επιμορφωτικά σεμινάρια.
Technology of gene silencing. Histrory data, principle of methods and applications. Training seminars.

Κοιλιάρη, Σοφία

Σκορίλας, Ανδρέας
Σταθόπουλος, Κωσταντίνος

The term gene silencing is used in general to subscribe the "deletion" of a gene by a mechanism other than genetic modification. Therefore, a gene that would be expressed (activated) under normal conditions is inactivated by the machines in the cell. Gene silencing is a complicated mechanism that is still not fully identified by all its participants. Its role appears to be critical to the organism defense against exogenous sequences from viruses, bacteria, transposons and transgenes. An important role is also in regulating the expression of genes involved in developmental pathways, mechanisms of cell differentiation and morphogenesis. The phenomenon of silencing a gene through RNAi was first discovered in the Caenorhabditis elegans filamentous worm by Fire and Melo in 1998. The genes are regulated at either transcriptional or post-transcriptional level. Transcriptional gene silencing is the result of histone modifications, creating a heterochromatin environment around a gene that renders it inaccessible to a transcription engine (RNA polymerase, transcription factors, etc.). Post-transcriptional gene silencing is the result of mRNA of a particular gene that is destroyed or blocked. The basic mechanism and proteins associated with RNA silencing are conserved among the kingdoms, but there are no significant differences in the exact involved pathway due to a different organism, the nature of the target gene and the mode of insertion of the starting silencing molecule. The silencing pathways share three common biochemical features: double-stranded RNA (dsRNA), cutting into small single-stranded ribonucleic modulators (small RNAs) and finally the small RNA inhibitory activity by means of suitable complexes in partially or fully complementary RNA or DNA.The mechanism is triggered by the presence of double-stranded RNA. This may be of exogenous origin, complete internal complementarity, and lead to the creation of siRNAs, whether derived from endogenous transcripts that, due to internal incomplete complementarity, form a loop structure leading to the creation of microRNAs (miRNAs). The double-stranded form of RNA is recognized by Dicer family proteins and cut into small-sized double-stranded RNA. These proteins are ATP-dependent, RNAse III endonucleases carrying double-stranded RNA binding domains and have a major role in the mechanism. The small RNA molecule becomes single-stranded and integrated into RISC induced silencing complex. These complexes are heterogeneous, but all of them contain proteins from the ARGONAUTE family and are responsible for the inhibitory action resulting from the nature of small RNAs. Argonautes proteins play an important role, as they are the ones that lead the small ribonucleic regulator, lead to suppression of expression either by degrading the target or by preventing its transcription or translation. They contain small RNAs binding region at the amino terminus (PAZ region) and a C-terminal region (PIWI area) with activity-like RNAsisI, which imparts the cutting capacity transcripts targeted for degradation. Finally, some of the paths of Silence have the characteristic of feedback. More specifically, the same mechanism "creates" double-stranded RNA that triggers the silencing. Responsible for this function are the RNA-dependent-RNA polymerases (RdRs), which die single stranded RNA, and means or not a primer producing double-stranded RNA, which becomes the substrate of Dicer family. The introduction of exogenous dsRNA into the cell is mainly accomplished by microinjection or immersion of the organism into a dsRNA solution. Recently, application efforts have focused on the administration of RNAi through food because this method is less demanding and easier to handle as well as more economical and less time-consuming. In addition, it is the most feasible and immediate approach to implementing RNAi technology at the population level. The use of RNAi technology is used in both in vitro and in vivo studies with a view to understanding the function of a particular protein (or more). Using RNAi, it is possible to investigate the role of proteins in complex cellular phenomena such as: proteins involved in signal transduction, cell cycle regulating proteins, proteins involved in cell death-apoptosis, proteins that contribute to cellular growth and mobility, and invasion of viruses a cells. The most obvious use of RNAi technology is to treat patients in whom shedding of one or some genes could slow down or even stop the progression of the disease to specific cells that manifest the disease-related disorder. The goals of therapeutic use of RNAi technology include a wide range of proteins that are related to a similar range of diseases and disorders. These disorders include, among many others, cancer, bacterial infections and virus-related diseases.
κείμενο, πίνακας, σχήματα, εικόνες
Ο όρος γονιδιακή αποσιώπηση χρησιμοποιείται γενικά για να περιγράψει το «σβήσιμο» ενός γονιδίου από ένα μηχανισμό διαφορετικό από τη γενετική τροποποίηση. Δηλαδή, ένα γονίδιο το οποίο θα εκφραζόταν (ενεργοποιημένο) υπό κανονικές συνθήκες είναι απενεργοποιημένο από τις μηχανές στο κύτταρο. Η γονιδιακή σίγηση αποτελεί έναν πολύπλοκο μηχανισμό που ακόμα όλοι οι συμμετέχοντες παράγοντές του δεν έχουν πλήρως ταυτοποιηθεί. Ο ρόλος του φαίνεται να είναι καθοριστικός για την άμυνα του οργανισμού απέναντι σε εξωγενείς αλληλουχίες από ιούς, βακτήρια, μεταθετά στοιχεία και διαγονίδια. Σημαντικό ρόλο έχει, επίσης, στη ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων που συμμετέχουν σε αναπτυξιακά μονοπάτια, σε μηχανισμούς κυτταρικής διαφοροποίησης και μορφογένεσης. Το φαινόμενο της σίγησης ενός γονιδίου μέσω του RNAi ανακαλύφτηκε αρχικά στον νηματοειδή σκώληκα Caenorhabditis elegans από τους Fire και Melo το 1998. Τα γονίδια ρυθμίζονται είτε σε μεταγραφικό και μετα-μεταγραφικό επίπεδο. Η μεταγραφική σίγηση γονιδίων είναι το αποτέλεσμα των τροποποιήσεων των ιστονών, δημιουργώντας ένα περιβάλλον ετεροχρωματίνης γύρω από ένα γονίδιο που το καθιστά απρόσιτο σε μεταγραφική μηχανή (RNA πολυμεράση, μεταγραφικούς παράγοντες, κ.λπ.). Η μεταμεταγραφική σίγηση γονιδίων είναι το αποτέλεσμα του mRNA ενός συγκεκριμένου γονιδίου το οποίο καταστρέφεται ή μπλοκάρεται. Ο βασικός μηχανισμός και οι πρωτεΐνες που σχετίζονται στη σίγηση μέσω RNA είναι συντηρημένα ανάμεσα στα βασίλεια, χωρίς να εκλείπουν όμως σημαντικές διαφορές στο ακριβές εμπλεκόμενο μονοπάτι που θα ακολουθηθεί, ένεκα διαφορετικού οργανισμού, φύσης του γονιδίου-στόχου και τρόπου εισαγωγής του εναρκτήριου μορίου σίγησης Τα μονοπάτια της σίγησης μοιράζονται τρία κοινά βιοχημικά χαρακτηριστικά: τη δημιουργία δίκλωνου RNA (dsRNA), την κοπή του σε μικρούς μονόκλωνους ριβονουκλεϊκούς ρυθμιστές (μικρά RNAs) και τέλος την παρεμποδιστική δράση του μικρού RNA με τη βοήθεια κατάλληλων συμπλόκων σε μερικώς ή πλήρως συμπληρωματικό RNA ή DNA. Ο μηχανισμός ενεργοποιείται από την παρουσία δίκλωνου RNA. Αυτό μπορεί να είναι εξωγενούς προέλευσης, πλήρους εσωτερικής συμπληρωματικότητας και να οδηγεί στη δημιουργία των siRNAs, είτε προερχόμενο από ενδογενή μετάγραφα που λόγω εσωτερικής, μη πλήρους συμπληρωματικότητας διαμορφώνουν δομή θηλιάς οδηγώντας στην δημιουργία των micro-RNAs (miRNAs). Η δίκλωνη μορφή του RNA αναγνωρίζεται από πρωτεΐνες της οικογένειας Dicer και κόπτεται σε δίκλωνο RNA μικρού μεγέθους. Οι πρωτεΐνες αυτές είναι ATP εξαρτώμενες, RNAse III ενδονουκλεάσες που φέρουν περιοχές πρόσδεσης δίκλωνου RNA και κατέχουν σημαντικότατο ρόλο στο μηχανισμό. Το μικρό μόριο RNA καθίσταται μονόκλωνο και ενσωματώνεται σε σύμπλοκα σίγησης RISC (RNA induced silencing complex). Τα σύμπλοκα αυτά παρουσιάζουν ετερογένεια, αλλά όλα ανεξαιρέτως περιέχουν πρωτεΐνες της οικογένειας Αργοναυτών (ARGONAUTE) και είναι υπεύθυνα για την παρεμποδιστική δράση που απορρέει από τη φύση των μικρών RNAs. Οι πρωτεΐνες Αργοναύτες κατέχουν σημαντικό ρόλο, καθώς είναι αυτές που με οδηγό το μικρό ριβονουκλεϊκό ρυθμιστή, οδηγούν σε καταστολή της έκφρασης, είτε αποικοδομώντας το στόχο, είτε παρεμποδίζοντας τη μεταγραφή ή τη μετάφρασή του. Περιέχουν περιοχή πρόσδεσης μικρών RNAs στο αμινοτελικό τους άκρο (PAZ περιοχή) και μία καρβοξυτελική περιοχή (PIWI περιοχή) με δράση ομοιάζουσα της RNAσηςΗ , η οποία προσδίδει την ικανότητα κοπής σε μετάγραφα που στοχεύονται για αποικοδόμηση. Τέλος, ορισμένα από τα μονοπάτια της σίγησης έχουν το χαρακτηριστικό της ανατροφοδότησης. Πιο συγκεκριμένα, ο ίδιος ο μηχανισμός «δημιουργεί» δίκλωνο RNA που πυροδοτεί τη σίγηση. Υπεύθυνες για τη λειτουργία αυτή είναι οι RNA-εξαρτώμενες-RNA πολυμεράσες (RdRs), οι οποίες με μήτρα μονόκλωνο RNA και τη βοήθεια ή όχι κάποιου εκκινητή παράγουν δίκλωνο RNA, το οποίο γίνεται υπόστρωμα των μελών της οικογένειας Dicer. Η εισαγωγή του εξωγενούς dsRNA στο κύτταρο πραγματοποιείται κυρίως με μικροένεση ή εμβάπτιση του οργανισμού σε διάλυμα dsRNA. Πρόσφατα οι προσπάθειες εφαρμογής στράφηκαν προς τη χορήγηση του RNAi μέσω της τροφής διότι η συγκεκριμένη μέθοδος είναι λιγότερο απαιτητική και πιο εύκολη στο χειρισμό της καθώς και πιο οικονομική και λιγότερο χρονοβόρα. Επιπλέον αποτελεί την πιο εφικτή και άμεση προσέγγιση για την εφαρμογή της τεχνολογίας RNAi σε επίπεδο πληθυσμού. Η χρήση της τεχνολογίας του RNAi χρησιμοποιείται τόσο σε in vitro, όσο και σε in vivo μελέτες με απώτερο σκοπό την κατανόηση της λειτουργίας μιας συγκεκριμένης (ή περισσότερων) πρωτεϊνών.Με τη χρήση του RNAi καθίσταται δυνατή η διερεύνηση του ρόλου των πρωτεϊνών σε πολυσύνθετα κυτταρικά φαινόμενα όπως είναι: πρωτεΐνες που συμμετέχουν στη μεταγωγή του σήματος, πρωτεΐνες που ρυθμίζουν τον κυτταρικό κύκλο, πρωτεΐνες πον συμμετέχουν στον κυτταρικό θάνατο-απόπτωση, πρωτεΐνες που συμβάλλουν στην κυτταρική ανάπτυξη και κινητικότητα και η εισβολή των ιών στα κύτταρα. Η πιο προφανής ίσως χρήση της τεχνολογίας του RNAi αφορά στην αντιμετώπιση των ασθενετών στις οποίες η σίγηση ενός ή ορισμένων γονιδίων θα μπορούσε να επιβραδύνει ή ακόμη και να σταματήσει την πρόοδο της ασθένειας στα συγκεκριμένα κύτταρα τα οποία εκδηλώνουν την ανωμαλία που συνδέεται με την ασθένεια. Οι στόχοι της θεραπευτικής χρήσης της τεχνολογίας του RNAi περιλαμβάνουν ένα ευρύ φάσμα πρωτεϊνών οι οποίες σχετίζονται με ένα ανάλογο φάσμα νόσων και διαταραχών. Αυτές οι διαταραχές περιλαμβάνουν μεταξύ πολλών άλλων τον καρκίνο, τις βακτηριακές λοιμώξεις και τις ασθένειες που οφείλονται σε ιούς.

Διπλωματική Εργασία / Thesis

γονιδιακή αποσιώπηση
TGS
RNAi
PTGS
miRNA
siRNA

Ελληνικό Ανοικτό Πανεπιστήμιο (EL)
Hellenic Open University (EN)

Ελληνική γλώσσα

2018-05-21T11:52:58Z
2018-05-05


Ελληνικό Ανοικτό Πανεπιστήμιο / Hellenic Open University

1
2
92



*Η εύρυθμη και αδιάλειπτη λειτουργία των διαδικτυακών διευθύνσεων των συλλογών (ψηφιακό αρχείο, καρτέλα τεκμηρίου στο αποθετήριο) είναι αποκλειστική ευθύνη των αντίστοιχων Φορέων περιεχομένου.