Processing of biomaterials surfaces for gene delivery applications

RDF 

 
Το τεκμήριο παρέχεται από τον φορέα :
Πανεπιστήμιο Κρήτης
Αποθετήριο :
E-Locus Ιδρυματικό Καταθετήριο
δείτε την πρωτότυπη σελίδα τεκμηρίου
στον ιστότοπο του αποθετηρίου του φορέα για περισσότερες πληροφορίες και για να δείτε όλα τα ψηφιακά αρχεία του τεκμηρίου*
κοινοποιήστε το τεκμήριο



Σημασιολογικός εμπλουτισμός/ομογενοποίηση από το EKT
2016 (EL)
Κατεργασία επιφανειών βιοϋλικών για εφαρμογές στην μεταφορά γονιδίων
Processing of biomaterials surfaces for gene delivery applications

Ασλάνογλου, Στέλλα Λ.

Στρατάκης, Εμμανουήλ
Φωτάκης, Κωνσταντίνος
Λουκάκος, Παναγιώτης
Αναστασιάδης, Σπύρος

Περίπου 4000 ανθρώπινες ασθένειες έχουν σχετιστεί με γενετικές ανωμαλίες μέχρι στιγμής (1). Οι περισσότερες από αυτές είναι απειλητικές για την ζωή των ασθενών και επηρεάζουν όλες τις πτυχές της ζωής τους σε καθημερινή βάση. Ο μόνος τρόπος να εξαλείψει κανείς μια γενετική ασθένεια είναι να την θεραπεύσει στη ρίζα της. Η γονιδιακή θεραπεία είναι μια πειραματική τεχνική, η οποία λειτουργεί σε αυτή την κατεύθυνση χρησιμοποιώντας διαφορετικές προσεγγίσεις, οι οποίες περιλαμβάνουν την αντικατάσταση ή την "σίγαση" ενός μεταλλαγμένου γονιδίου και την εισαγωγή ενός καινούργιου. Η ενδοκυτταρική μεταφορά γεννετικού υλικού είναι ευρέως γνωστή ως "διαμόλυνση" (transfection) και πραγματοποιείται με την χρήση ιών και μη. Η μεταφορά γονιδίων σε ανθρώπινα κύτταρα χρησιμοποιώντας μεθόδους που δεν περιλαμβάνουν τη χρήση ιών έχει γίνει μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση στη γονιδιακή θεραπεία τα τελευταία χρόνια (2). Ένα από τα τρέχοντα εμπόδια στην επιτυχή γονιδιακή θεραπεία είναι η ανεπαρκής μεταφορά του διορθωτικού γονιδίου στα στοχευμένα κύτταρα. Νέες μέθοδοι απαιτούνται για την μεταφορά νουκλεϊκών οξέων σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων αποτελεσματικά και με υψηλές αποδόσεις. Σε αυτή την εργασία, παρουσιάζουμε την ανάπτυξη μιας καινοτόμας πλατφόρμας μεταφοράς για διαμόλυνση κυττάρων in vitro, αποτελούμενη από συστοιχίες κάθετα προσανατολισμένων νανοσυρμάτων πυριτίου (VA-SiNWs) κωνικού προφίλ, τα οποία ονομάστηκαν "μικρο-κωνικές ακίδες πυριτίου". Η κατασκευή ξεκινά με την αυτοδιάταξη (self-assembly) μιας εξαγωνικής συμπυκνωμένης δυσδιάστατης συστοιχίας νανοσφαιρών πολυστυρενίου πάνω σε μια μεγάλη επιφάνεια πυριτίου μέσω επαγωγικής διάταξης (convective assembly). Η προκύπτουσα μονοστρωματική εξαγωνική συμπυκνωμένη συστοιχία των νανοσφαιρών πολυστυρενίου μετατρέπεται σε μη συμπυκνωμένες συστοιχίες μέσω εγχάραξης (etching) με πλάσμα οξυγόνου. Οι εγχαραγμένες νανοσφαίρες πολυστυρενίου λειτουργούν έπειτα σαν μάσκα για την βαθιά εγχάραξη μέσω ενεργών ιόντων του πυριτίου χρησιμοποιώντας την διαδικασία "Bosch". Το τελευταίο βήμα στην κατασκευή των μικρο-κωνικών ακίδων πυριτίου είναι η διαμόρφωση μιας πιο λείας και αιχμηρής μορφολογίας χρησιμοποιώντας ένα συνδυασμό θερμικής οξείδωσης και υγρής εγχάραξης. Οι συστοιχίες αυτές μικρο-κωνικών ακίδων πυριτίου, ταξινομήθηκαν σε τρεις κατηγορίες, με βάση το ύψος των ακίδων, εμφανίζοντας μια ποικιλία αρχιτεκτονικών (Πίνακας 4.2) και χρησιμοποιήθηκαν μαζί με επίπεδο πυρίτιο σε in vitro κυτταρικές καλλιέργειες χρησιμοποιώντας σαν μοντέλο την κυτταρική σειρά ΗΕΚ293 (εμβρυονικά ανθρώπινα νεφρικά κύτταρα). Έπειτα από την λειτουργικοποίηση της επιφάνειας των συστοιχιών μικρο-κωνικών ακίδων με πλασμίδιο που έχει κωδικοποιημένη πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη, πραγματοποιήθηκε η μεταφορά του πλασμιδίου με μηχανική διείσδυση χρησιμοποιώντας την φυγόκεντρο, με τις ακίδες στραμμένες προς τα κύτταρα (Μέθοδος Μεταφοράς 1). Ένα τέτοιο σύστημα μεταφοράς μπορεί να μας προσφέρει δύο κύρια πλεονεκτήματα: γρήγορη και παράλλη μεταφορά του πλασμιδίου σε μια μεγάλη ποσότητα κυττάρων. Πριν προχωρήσουμε στα πειράματα διαμόλυνσης των κυττάρων, εξετάσαμε την βιωσιμότητα αυτών κατά την διάρκεια της επαφής τους με τις μικρο-κωνικές ακίδες καθώς και την ύπαρξη ή όχι διείσδυσης αυτών στο κυτταρόπλασμα μέσω της κυτταρικής μεμβράνης με την βοήθεια FIB-SEM. Τα πειράματα βιωσιμότητας των κυττάρων έδειξαν πως μια παρατεταμένη (για μερικές ώρες) επώαση της όλης προαναφερθείσας διάταξης οδηγεί σταδιακά στο θάνατο των κυττάρων και στις δύο περιπτώσεις. Τόσο στο ίχνος που αφήνουν οι μικρο-κωνικές ακίδες, μετά την αφαίρεσή τους, στα πηγάδια καλλιέργειας αλλά και στην ίδια την επιφάνεια των ακίδων. Αυτό πιθανά αποδίδεται στην έλλειψη οξυγόνου και θρεπτικών συστατικών που ήταν διαθέσιμα στα κύτταρα κατά την επαφή. Παρ’όλα αυτά όμως, μια σύντομη επώαση (το πολύ 30 λεπτών) αφήνει όλα τα κύτταρα ζωντανά. Επιπλέον η παραμονή προσκολλημένων κυττάρων στην επιφάνεια των πηγαδιών καλλιέργειας, μας αφήνει το ενδεχόμενο να επιτύχουμε διαμόλυνση των κυττάρων και στα πηγάδια καλλιέργειας. Όσον αφορά την απεικόνιση με FIB-SEM, οι εικόνες φθορισμού που πήραμε αποκάλυψαν την επιτυχή διείσδυση των μικρο-κωνκών ακίδων, όλων των χαρακτηριστικών, στο κυτταρόπλασμα μέσα σε 15 και 30 λεπτά επώασης αντίστοιχα. Αυτή είναι μια καλή αλλά όχι επαρκής ένδειξη πως θα έχουμε και διαμόλυνση των κυττάρων. Τέλος, προχωρήσαμε σε πειράματα διαμόλυνσης των κυττάρων για να εξετάσουμε την αποτελεσματικότητα του συστήματος μεταφοράς μας. Για συγκριτικούς λόγους, πειράματα διαμόλυνσης των κυττάρων πραγματοποιήθηκαν με την χρήση και μιας επιπλέον μεθόδου (τα κύτταρα πάνω από τις μικρο-κωνικές ακίδες – Μέθοδος Μεταφοράς 2) ακολουθώντας ένα παρόμοιο πρωτόκολλο. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι είχαμε διαμόλυνση των κυττάρων με την χρήση και των δύο μεθόδων μεταφοράς. Τα διαμολυσμένα κύτταρα ανιχνεύθηκαν στην επιφάνεια των συστοιχιών από μικρο-κωνικές ακίδες και κυρίως σε εκείνες που αποτελούνταν από ταυτόχρονα υψηλότερες και αιχμηρότερες ακίδες. Παρ’όλα αυτά, κανένα διαμολυσμένο κύτταρο δεν ανιχνεύτηκε στα πηγάδια καλλιέργειας χρησιμοποιώντας την Μέθοδο Μεταφοράς 1 (μικρο-κωνικές ακίδες πάνω από τα κύτταρα) μέσα σε 20 λεπτά επώασης. Συνοψίζοντας, σε αυτή την εργασία παρουσιάσαμε αρχικά μία καινοτόμο μέθοδο για την κατασκευή κάθετα ευθυγραμμισμένων συστοιχιών νανοσυρμάτων πυριτίου με κωνικό προφίλ χρησιμοποιώντας ένα συνδυασμό λιθογραφίας νανοσφαιρών και βαθιάς εγχράραξης με την χρήση ενεργών ιόντων. Σε δεύτερο στάδιο, χρησιμοποιήσαμε αυτές τις συστοιχίες νανοσυρμάτων πυριτίου σαν πλατφόρμα διαμόλυνσης (transfection) κυττάρων in vitro για την μεταφορά πλασμιδιακού DNA σε κύτταρα HEK293. Η μεταφορά του πλασμιδίου επιτυγχάνεται με μηχανική διείσδυση των νανοσυρμάτων μέσα στο κυτταρόπλασμα με την βοήθεια της φυγόκεντρου, χρησιμοποιώντας ένα πολύ σύντομο πρωτόκολλο. Προτείνουμε ότι ένα τέτοιο σύστημα μεταφοράς θα μπορούσε να είναι ένα μελλοντικό εργαλείο στην διευκόλυνση των πρακτικών της γονιδιακής θεραπείας. (EL)
Around 4000 human diseases have been traced to gene disorders so far (1). Most of them are life-threatening and affect all aspects of patient’s life in a daily basis. The only way to eliminate a genetic disease is to treat it at its roots. Gene therapy is an experimental technique that works in this direction by using different approaches including the replacement or the "silencing" of a mutated gene and the introduction of a new gene. The intracellular delivery of genetic material is well known as "transfection" and it is either viral or non-viral. The delivery of genes to mammalian cells using non-viral methods has become a very promising approach for gene therapy in the last few years (2). One of the current impediments of successful gene therapy is the inefficient delivery of the corrective nucleic acid code into target cells. New methods are required to deliver nucleic acid reagents into diverse cell types effectively and with high yields. In this study, we report on the development of a novel delivery platform for cell transfection studies in vitro, comprising of vertically aligned silicon nanowire (VA-SiN) arrays with a tapered profile, termed as "silicon micro-conical tips (Si MC tips)". Fabrication starts with self-assembly of a hexagonal close-packed (hcp) 2D array of polystyrene nanospheres (PSNS) over a large area of a Si wafer via convective assembly. The resulting hcp monolayer array is then converted into non-close-packed monolayer arrays using O2 plasma etching. The etched PSNS then serve as a mask for the Deep Reactive Ion Etching (DRIE) of silicon using the "Bosch" process. The final step in the fabrication of the micro-conical arrays is the formation of a smoother and sharper morphology using a combination of thermal oxidation and wet etching. These arrays were classified in three different categories, regarding the height of the tips, exhibiting a range of architectures (Table 4.2) and together with flat Si wafers have been applied to in vitro cell cultures using HEK293 cells as a model cell line. After the functionalization of the Si MC tip arrays’ surface with Green Fluorescent Protein (GFP)-plasmid, the delivery was performed by mechanical penetration using centrifugation force, with the Si MC tips facing towards the cells (Delivery Method 1). A delivery system like this can offer us two main advantages: fast delivery and parallel delivery of the plasmid to a huge amount of cells. Before proceeding to cell transfection studies, we examined the viability of the cells during their contact with the Si MC tips as well as the existence or not of penetration through the cell membrane into the cytoplasm by FIB-SEM. The viability studies performed demonstrated that a prolonged incubation (for a couple of hours) of the aforementioned setup leads progressively to the death of the cells in both cases. At the footprint that the Si MC tips leave, after their removal, on the well plate and at the Si MC tips themselves. This is probably attributed to the lack of oxygen and nutrition available to the cells during the contact. However, a short incubation of maximum 30 m time leaves all the cells alive. In addition, there are still remaining cells attached on the well plate, fact that gives us the potential of achieving transfection on the well plate as well. As far as the FIB-SEM imaging is concerned, the fluorescent images taken revealed the successful cytoplasm penetration of the Si MC tips of all different characteristics within 15 m and 30 m incubation time respectively. This is a good but not an adequate indicator that we will have transfection as well. Finally, we proceeded to transfection studies in order to test the efficacy of our plasmid DNA delivery system. For comparative reasons, cell transfection studies were performed employing an additional strategy (cells on top of the Si MC tips – Delivery Method 2) and following a similar protocol. Our results showed that cell transfection was achieved using both delivery methods. Transfected cells were detected on the surface of the Si MC tip arrays and especially on those comprising of higher and pointed tips in the same time. However, no transfected cells were detected on the well plate using Delivery Method 1 (Si MC tips on top of the cells) within 20 m of incubation. To sum up, in this study we presented at first a novel method for the fabrication of vertically aligned silicon NW arrays with a tapered profile using a combination of nanosphere lithography and deep reactive ion etching. At a second step, we used these SiNW arrays as a cell transfection platform in vitro in order to deliver plasmid DNA into HEK293 cells. The delivery of the plasmid is achieved by mechanical penetration of the NWs into the cytoplasm with the aid of centrifugation force using a very short experimental protocol. We suggest that a delivery system like this could be a future tool in facilitating gene therapy practices. (EN)

text

Γονιδιακή θεραπεία
Γονίδιο
DRIE
Silicon
Βιοϋλικά
Gene therapy

Πανεπιστήμιο Κρήτης (EL)
University of Crete (EN)

2016-07-22




*Η εύρυθμη και αδιάλειπτη λειτουργία των διαδικτυακών διευθύνσεων των συλλογών (ψηφιακό αρχείο, καρτέλα τεκμηρίου στο αποθετήριο) είναι αποκλειστική ευθύνη των αντίστοιχων Φορέων περιεχομένου.