Ο πρώτος στόχος ήταν η μελέτη της επίδρασης της συντήρησης σε φορμόλη και υγρό άζωτο στο φάσμα φθορισμού επαγόμενου από λέιζερ των περιφερειακών αγγείων. Για την διέγερση των δειγμάτων χρησιμοποιήθηκαν τα λέιζερ Ηλίου-Καδμίου (442nm) και ιόντων Αργού (457.9, 476.5, 488, 496.5, και 501.7nm) σε ξεχωριστές σειρές μετρήσεων. Όλα τα δείγματα πάρθηκαν από εγχειρήσεις by-pass και ακρωτηριασμούς που έγιναν στην Αγγειοχειρουργική Κλινική του Πανεπιστημίου Κρήτης και ακτινοβολήθηκαν περίπου μία ώρα μετά την εκτομή τους. Πραγματοποιήθηκε σύγκριση των φασμάτων φθορισμού των ιστών όταν ήταν νωποί και μετά τη συντήρηση τους σε φορμόλη ή υγρό άζωτο για 24 και 48 ώρες. Η σύγκριση των σημάτων φθορισμού έγινε με την εφαρμογή δώδεκα (12) απλών αλγεβρικών αλγορίθμων, οι οποίοι ήταν βασισμένοι στις διαφορές της έντασης των καταγραφόμενων φασμάτων. Όλες οι in vitro μελέτες φασματοσκοπίας φθορισμού επαγόμενου από λέιζερ πάνω σε ανθρώπινους ιστούς πραγματοποιήθηκαν κατόπιν συντήρησης των δειγμάτων για κάποιο χρονικό διάστημα σε φορμόλη ή υγρό άζωτο. Μέχρι τώρα δεν υπήρξε καμία εκτεταμένη μελέτη για το ρόλο της συντήρησης σε φορμόλη ή υγρό άζωτο στα σήματα φθορισμού. Η έλλειψη στη διεθνή βιβλιογραφία μίας τέτοιας έρευνας έκανε επιτακτική την ανάγκη υλοποίησης της. Οι στόχοι της παρούσας εργασίας ήταν: η διερεύνηση των αλλοιώσεων στα φάσματα που οφείλονται αποκλειστικά στην συντήρηση, η μελέτη του χρόνου που απαιτείται για τη δημιουργία αυτών των αλλοιώσεων και η ανάδειξη του τρόπου συντήρησης που επιφέρει τις λιγότερες δυνατές αλλαγές στην κατανομή των συλλεγόμενων σημάτων φθορισμού. Οι αλγόριθμοι εμφάνισαν καλύτερα αποτελέσματα σε ότι αφορά τη διάκριση των ιστών, για συντήρηση σε φορμόλη σε σχέση με το υγρό άζωτο. Μερικοί από τους αλγόριθμους κατάφεραν να ανιχνεύσουν αλλαγές στα σήματα φθορισμού των δειγμάτων όταν ήταν νωπά και μετά τη συντήρηση τους για ένα εικοσιτετράωρο σε φορμόλη ή υγρό άζωτο. Όμως για το χρονικό διάστημα μεταξύ 24 και 48 ωρών όλοι οι αλγόριθμοι παρουσίασαν πολύ χαμηλά ποσοστά επιτυχίας. Τα αποτελέσματα έδειξαν ισχυρές ενδείξεις ότι η συντήρηση σε υγρό άζωτο δεν αλλάζει σημαντικά τα φασματικά χαρακτηριστικά των ιστών. Αντίθετα, η συντήρηση σε φορμόλη φαίνεται να επηρεάζει και να αλλοιώνει την κατανομή των φασμάτων φθορισμού των περιφερειακών αγγείων, μέσα στις πρώτες 24 ώρες. Η διερεύνηση των πιθανοτήτων για την επίτευξη της διάκρισης μεταξύ παθολογικών και φυσιολογικών περιφερειακών αγγείων (in vitro), με τη χρήση φασματοσκοπίας φθορισμού επαγόμενου από λέιζερ αποτέλεσε το δεύτερο στόχο αυτής της εργασίας. Για την ακτινοβόληση των δειγμάτων χρησιμοποιήθηκαν πάλι τα λέιζερ Ηλίου-Καδμίου (442nm) και ιόντων Αργού (457.9, 476.5. 488 και 496.5nm). Οι ιστοί διεγέρθηκαν με τη χρήση ενός ή δύο διαφορετικών μηκών κύματος ταυτόχρονα. Τα δείγματα (λαγόνιες, μηριαίες, ιγνυακές, κνημιαίες περονιαίες αρτηρίες, κοιλιακές αορτές) προέρχονταν και σε αυτή την περίπτωση από εγχειρήσεις by-pass και ακρωτηριασμούς που έγιναν στην προαναφερθείσα Κλινική. Ο διαχωρισμός και η ταξινόμηση των διαφορετικών τύπων ιστών (φυσιολογική αρτηρία, ινώδη πλάκα, ασβεστοποιημένη πλάκα) πραγματοποιήθηκε με την εφαρμογή 12 απλών αλγεβρικών αλγορίθμων που σχετίζονταν με τα συλλεγόμενα φάσματα, καθώς και με τη μελέτη του μέγιστου πλάτους στο μισό του ύψους. Επίσης, ένας αριθμός από τα φάσματα φθορισμού που εξήχθησαν επεξεργάστηκαν με τη χρήση τεχνητού νευρωνικού δικτύου, έχοντας ως στόχο την πιο λεπτομερειακή ανάλυση των καταγραφόμενων σημάτων. Επιπλέον, ερευνήθηκε ο τρόπος διέγερσης (ένα ή δύο διαφορετικά μήκη κύματος) των περιφερειακών αγγείων που αποδίδει καλύτερα αποτελέσματα σε ότι αφορά τη διάκριση τους. Τέλος, μελετήθηκε ένας περιορισμένος αριθμός in vivo μετρήσεων φθορισμού που πάρθηκαν από εγχειρήσεις by-pass, με γραμμή εκπομπής στα 442nm (Ήλιο-Κάδμιο). Οι in vivo μετρήσεις έγιναν στο The Royal London Hospital στο Whitechapel του Λονδίνου. Ο κυριότερος στόχος της συγκεκριμένης μελέτης, ήταν η διερεύνηση των πιθανοτήτων για την κλινική χρήση αυτής της σχετικά καινούργιας ελάχιστα επεμβατικής τεχνικής (φασματοσκοπία φθορισμού επαγόμενου από λέιζερ), ως διαγνωστικού μέσου για την έγκαιρη ανίχνευση νοσηρών περιφερειακών αγγείων. Η συλλογή των δεδομένων και η ανάλυση τους πραγματοποιήθηκε σε σχετικά μικρό χρονικό διάστημα (μερικά δευτερόλεπτα), έτσι ώστε να καταστεί δυνατή η χρήση αυτής της τεχνικής και σε in vivo μετρήσεις. Το βασικό πλάνο είναι η χρησιμοποίηση αυτής της μεθόδου, σε συνεργασία με τις υπάρχουσες διαγνωστικές τεχνικές, για την εξαγωγή όσο το δυνατόν πιο βελτιωμένων αποτελεσμάτων που αφορούν στην έγκαιρη και αξιόπιστη ανίχνευση παθήσεων των περιφερειακών αγγείων. Στις in vitro μετρήσεις, με τους αλγόριθμους έγινε δυνατή η διαχώριση τόσο του φυσιολογικού από τον ινώδη ιστό, όσο και του φυσιολογικού από τον ασβεστοποιημένο αρτηριακό ιστό. Η χρήση δύο διαφορετικών μηκών κύματος ταυτόχρονα για διέγερση φαίνεται να αποδίδει καλύτερα αποτελέσματα στην εφαρμογή των αλγόριθμων για τη διάκριση των διαφορετικών τύπων ιστών. Αυτό ήταν πιο εμφανές στην περίπτωση σύγκρισης φυσιολογικού και ινώδους ιστού. Κατά την ακτινοβόληση των δειγμάτων με τις γραμμές στα 442nm+488nm και στα 442nm+496.5nm εξήχθησαν τα καλύτερα αποτελέσματα ως προς την ταξινόμηση των διαφορετικών τύπων ιστών. Επίσης, μερικά από τα συλλεγόμενα φάσματα φθορισμού αναλύθηκαν με τη χρήση νευρωνικών δικτύων. Η επεξεργασία με νευρωνικά δίκτυα επέτρεψε, εκτός από τη διάκριση φυσιολογικού από ινώδη ή ασβεστοποιημένο ιστό και τη διάκριση της ινώδους από την ασβεστοποιημένη πλάκα. Στις in vivo μετρήσεις για τη διέγερση των δειγμάτων χρησιμοποιήθηκε μόνο η γραμμή στα 442nm (λέιζερ Ηλίου-Καδμίου). Τα αρχικά αποτελέσματα ήταν αρκετά ενθαρρυντικά σε ότι αφορά τη διάκριση φυσιολογικών από παθολογικά περιφερειακά αγγεία. Ωστόσο, περαιτέρω πειράματα (in vivo) είναι αναγκαία για να υποστηρίξουν και να επιβεβαιώσουν αυτές τις πρωταρχικές παρατηρήσεις. Η μελέτη φασμάτων φθορισμού από καρδιές ανθρώπων και αμνών (in vitro) συνιστά τον τρίτο στόχο αυτής της μελέτης. Ως πηγή διέγερσης χρησιμοποιήθηκε το λέιζερ ιόντων Αργού, με γραμμή εκπομπής στα 457.9nm. Τα δείγματα των αμνών συλλέχτηκαν αμέσως μετά την σφαγή των ζώων και εκτέθηκαν σε ακτινοβόληση μέσα στις δύο πρώτες ώρες από την εκτομή τους. Οι ανθρώπινες καρδιές προήλθαν από το νεκροτομείο και εξετάστηκαν μία ώρα μετά την εκτομή τους. Σήματα φθορισμού καταγράφηκαν από διάφορα καρδιακά τμήματα (αριστερό και δεξιό κόλπο και κοιλία, αορτή, μυοκάρδιο, επικάρδιο). Ερευνήθηκε η σταθερότητα των μετρήσεων μέσα σε κάθε ανατομική περιοχή της καρδιάς και έγινε προσπάθεια να διαχωριστούν με χρήση φασματοσκοπίας φθορισμού τα διάφορα καρδιακά τμήματα (με τη σύγκριση του ύψους της φασματικής έντασης, με την εφαρμογή αλγορίθμων). Επίσης, μελετήθηκαν οι διαφορές στην κατανομή των σημάτων φθορισμού που οφείλονταν στην επίδραση της συντήρησης των δειγμάτων σε φορμόλη (για 48 ώρες). Τέλος, αναλύθηκε ένας αριθμός από in vivo μετρήσεις που συλλέχτηκαν κατά την διάρκεια εγχειρήσεων ανοιχτής καρδιάς σε νοσοκομείο του Λονδίνου (Saint Bartholomew Hospital). Στα συγκεκριμένα πειράματα, για καθαρά πρακτικούς λόγους, ως πηγή διέγερσης χρησιμοποιήθηκε το λέιζερ Ηλίου-Καδμίου (442nm). Στην παρούσα εργασία εξετάστηκαν ολόκληρες και, κατά τεκμήριο, φυσιολογικές καρδιές. Με αυτό τον τρόπο μελετήθηκε ολοκληρωμένα το φάσμα εκπομπής του μυοκαρδιακού ιστού και έγινε προσπάθεια ανίχνευσης παθολογικών καταστάσεων του μυοκαρδίου. Ο απώτερος στόχος είναι η χρησιμοποίηση αυτής της διαγνωστικής μεθόδου, σε συνεργασία με τη συνήθη βιοψία, για την εξαγωγή βελτιωμένων αποτελεσμάτων. Τόσο στις καρδιές των ανθρώπων όσο και των αμνών παρατηρήθηκε αξιοσημείωτη σταθερότητα των μετρήσεων μέσα σε κάθε κοιλότητα (κόλπος, κοιλία). Όλα τα δείγματα που εξετάστηκαν χαρακτηρίστηκαν ως υγιή. Επομένως αναμένεται μία διαφοροποίηση στα σήματα φθορισμού που θα ληφθούν από νοσηρές περιοχές. Επιπλέον, σε όλες τις καρδιές (ανθρώπων και αμνών) που μελετήθηκαν, κυρίως η αορτή αλλά και οι κόλποι (ιδίως ο αριστερός), εμφάνισαν υψηλότερης έντασης σήματα φθορισμού συγκριτικά με άλλες ανατομικές περιοχές (π.χ. κοιλίες). Ακόμη, ανιχνεύτηκαν σημαντικές αλλαγές στην κατανομή των φασμάτων φθορισμού που εξήχθησαν (in vitro) από το μυοκάρδιο ανθρώπινων καρδιών, σε σχέση με τις υπόλοιπες περιοχές της καρδιάς. Μετά τη συντήρηση των δειγμάτων σε φορμόλη για 48 ώρες, ανιχνεύτηκαν αλλαγές στη φασματική τους κατανομή παρόμοιες με αυτές που διαπιστώθηκαν και στην περίπτωση συντήρησης σε φορμόλη περιφερειακών αγγείων. Τα σήματα φθορισμού που συλλέχτηκαν κατά τη διάρκεια των in vivo μετρήσεων σε ανθρώπινες καρδιές παρουσίασαν αρκετές ομοιότητες, τόσο στην μεταβολή της έντασης του σήματος στις διαφορετικές ανατομικές περιοχές όσο και στη μορφολογία, με τα φάσματα που καταγράφηκαν in vitro. Η μεθοδολογία και τα αποτελέσματα των ανωτέρω μελετών προσδοκάται να έχουν στο μέλλον κλινικές εφαρμογές στην διάγνωση των καρδιαγγειακών παθήσεων.
(EL)
The first scope of this work was to investigate the effects of liquid nitrogen and formalin-based conservation in the laser-induced fluorescence spectra taken from peripheral vascular tissue. A He-Cd laser emitting at 442nm and an Ar+ laser emitting at 457.9nm, 476.5nm, 488nm, 496.5nm and 501.7nm were used as excitation sources. Separate sets of measurements were made for all samples at each of these wavelengths. All samples were obtained from by-pass operations and amputations performed at the Vascular Surgery Clinic of the University of Crete. The samples were irradiated one hour after the excision. The fluorescence spectra from fresh tissues were compared to those taken after the tissues were stored in liquid nitrogen or formalin for 24 and 48 hours. The comparison of the fluorescence signals was made with the implementation of twelve (12) simple algebraic algorithms which were based on the intensity difference of the recorded spectra. All the in vitro laser induced fluorescence spectroscopy studies were performed after the conservation of the specimens for a certain time in formalin or in liquid nitrogen. So far the effects of the liquid nitrogen or formalin-based conservation in the fluorescence spectra of the tissues have not been extensively studied. The lack of this kind of study in the international literature made its realization a necessity. The aims of this study were: the investigation of the changes in the fluorescence spectra due to conservation, the study of the time required for the generation of such changes and the selection of a way of conservation which induces the less changes in the distribution of the recorded fluorescence signals. The algorithms seemed to give better results in the discrimination of the tissues, for formalin than for liquid nitrogen conservation. Some of the algorithms succeeded to detect changes in the fluorescence signal of tissue samples obtained directly after excision from those stored in liquid nitrogen or formalin for 24 hours, but usually failed to detect any variations between 24 and 48 hours. The results suggest that liquid nitrogen conservation does not seriously alter the spectral features of excised tissue whereas formalin conservation seem to affect the distribution of the laser induced fluorescence spectra within the first 24 hours. The second scope of this work was to investigate the feasibility of application of laser induced fluorescence spectroscopy (in vitro) in order to discriminate between normal and pathologic peripheral vascular tissue. A He-Cd laser emitting at 442nm and an Ar+ laser emitting at 457.9nm, 476.5nm, 488nm, 496.5nm were again used as excitation sources. All samples were subjected to either single or dual wavelength excitation from the He-Cd laser and one of the Ar+ laser emission lines. All the samples (abdominal aortas, as well as flank, femoral, tibial, fibular and ham artery tissues) were obtained from by-pass operations and amputations performed at the aforementioned Clinic. The discrimination and the classification of different types of tissue (normal artery, fibrous plaque, calcified plaque) was done with: i) the implementation of twelve (12) simple algebraic algorithms, which were related to the recorded spectra and ii) study of the full width at half maximum (FWHM) of the spectra. In addition, a number of the obtained fluorescence spectra was processed with the use of Artificial Neural Networks (ANN) in order to analyze them in a more detailed way. Furthermore, the way of excitation (single or dual wavelength) which gives the best results in terms of discrimination of tissues was investigated. Finally, a number of in vivo fluorescence measurements was taken during by-pass operations using as an excitation source a He-Cd laser. The in vivo measurements were performed at The Royal London Hospital, Whitechapel, London. The primary aim of this study, was to investigate the possibility for the clinical use of this relatively new, minimally invasive technique (laser-induced fluorescence spectroscopy), as a diagnostic tool for the early detection of diseased peripheral vascular tissues. The collection and the analysis of the data was made in a relatively small time interval (a few seconds), in order to make possible the application of this technique to in vivo measurements too. The intention is to use this technique in conjunction with the existing diagnostic methods, in order to obtain more accurate and reliable information about diseased peripheral vascular tissues at an early stage. In the case of in vitro measurements, the use of algorithms made possible the discrimination between normal and fibrous or calcified tissue. The application of the algorithms seemed to be more efficient regarding the discrimination of tissues in the case of dual wavelength excitation. This was more profound in the discrimination between normal and fibrous tissue. The best results were obtained when the combination of wavelengths 442nm + 488nm and 442nm + 496.5nm were used for the excitation of the samples. The analysis of the fluorescence spectra with Artificial Neural Networks (ANN) allowed not only the discrimination between normal and fibrous and normal and calcified tissue, but the discrimination between fibrous and calcified plaque as well. For the in vivo measurements the samples were subjected only to single wavelength excitation with the use of the He-Cd laser (442nm). Initial results were promising with respect to the discrimination between normal and abnormal vessels. Nevertheless, further studies are needed to support the preliminary observations. The third scope of this work was to investigate fluorescence spectra taken from lamb and human hearts (in vitro). An Ar+ laser emitting at 457.9nm was used for excitation. The lamb hearts were irradiated within the first two hours after the excision. The human hearts were obtained from the morgue and were irradiated one hour after the excision. Spectra from different cardiac compartments (the left and right atria and ventricles, the myocardium, the epicardium, the aorta and the fat deposits) were recorded. It was investigated whether each chamber exhibited constant spectral response. Efforts were also made to discriminate the different cardiac compartments, using laser-induced fluorescence spectroscopy, by comparing the spectral intensity and by using simple algorithms based on the spectral intensity variation. The alterations in the fluorescence spectra due to the conservation of the samples in formalin for 48 hours were also investigated. Finally, a number of in vivo measurements was taken during open heart operations at the Saint Bartholomew Hospital, London. Due to technical reasons, these measurements were performed using the He-Cd laser. In the present work healthy hearts were examined. In this way the emission spectrum of the myocardial tissue was investigated and an effort was made to detect any pathologic state of the myocardium. The aim is to use this diagnostic technique along with the ordinary biopsy, for the extraction of better results. It was observed that both in human and in lamb heart tissue all the measurements that were taken from the same chamber were remarkably constant. Since the samples were characterized as healthy, it is expected that there will be alterations in the fluorescence signals recorded from diseased parts. In all the hearts that were investigated (both human and lamb), the fluorescence spectra obtained from the aortas and the atria (in particular the left atrium) were more intense than the ones obtained from other parts (e.g. ventricles). The fluorescence spectra recorded from the myocardium of the human heart (in vitro) exhibited significant spectral differences from the ones recorded from other compartments of the heart. After the conservation of the human and lamb hearts in formalin for 48 hours, changes were observed in their spectral response, similar to those observed in the case of the peripheral vascular tissues. The fluorescence signals that were obtained during the in vivo measurements in human hearts presented a lot of similarities (in the morphology and in the change of the intensity of the signal from different cardiac compartments) with the spectra that were recorded in vitro. The methodology and the results of this work are expected to have clinical applications in the future of the diagnosis of cardiovascular diseases.
(EN)
