Ανάπτυξη και χρήση μεθόδων γενετικής μηχανικής για εφαρμογή στην καταπολέμηση του δάκου της ελιάς

 
This item is provided by the institution :
University of Crete
Repository :
E-Locus Institutional Repository
see the original item page
in the repository's web site and access all digital files if the item*
share



2007 (EN)
Ανάπτυξη και χρήση μεθόδων γενετικής μηχανικής για εφαρμογή στην καταπολέμηση του δάκου της ελιάς

Κουκίδου, Μάρθα

Παπαματθαιάκης, Ιωσήφ
Πανόπουλος, Ν.
Σαββάκης, Χαράλαμπος

Ο δάκος της ελιάς Bactrocera oleae (Dacus) αποτελεί το πιο καταστρεπτικό έντομο του ελαιόκαρπου παγκοσμίως. Υπάρχει ολοένα και αυξανόμενο ενδιαφέρον για βιολογικές μεθόδους ελέγχου του συγκεκριμένου είδους, εν μέρει εξαιτίας της επίγνωσης των ανθρώπων για την επιβλαβή επίδραση των χημικών εντομοκτόνων στο περιβάλλον και επίσης εξαιτίας της αυξανόμενης ανθεκτικότητας του εντόμου στα ήδη προϋπάρχονται εντομοκτόνα. Η Τεχνική Στείρου Εντόμου (SIT) αποτελεί μια νέα βιολογική μέθοδο καταπολέμησης των εντόμων οικονομικής σημασίας, με ευρεία εφαρμογή σε διάφορα μέρη του κόσμου. Περιλαμβάνει την καλλιέργεια μεγάλου αριθμού εντόμων, τα οποία στειρώνονται πριν την απελευθέρωση τους στη φύση. Παρόλο που αρχικά παράγονται ίσοι αριθμοί αρσενικών και θηλυκών ατόμων, τα θηλυκά διαχωρίζονται και απορρίπτονται πριν την απελευθέρωση, γιατί δε θεωρούνται χρήσιμα στην προσπάθεια ελέγχου του εντόμου στόχος. Άμα ικανοποιητικός αριθμός ανταγωνιστικών, στείρων αρσενικών απελευθερωθεί, η πλειονότητα των θηλυκών που απαντώνται στη φύση θα ζευγαρώσουν μαζί τους και επομένως δε θα προκύψουν βιώσιμοι απόγονοι. Στην παρούσα διατριβή, επιδείξαμε επιτυχή και σταθερό μετασχηματισμό της γαμετικής σειράς του δάκου, χρησιμοποιώντας ένα φορέα μετασχηματισμού Minos, ο οποίος εκφράζει τη φθορίζουσα πρωτεΐνη EGFP (Koukidou et al., 2006). Χρησιμοποιώντας την τεχνογνωσία που αναπτύξαμε όσον αφορά το μετασχηματισμό του εντόμου, ξεκινήσαμε την ανάπτυξη ενός γενετικά τροποποιημένου στελέχους του δάκου με στόχο την εφαρμογή του στην Τεχνική Στείρου Εντόμου, με βάση το γονίδιο φυλο-καθορισμού transformer 2 (tra2). Το γονίδιο tra2 είναι ένα από τα ρυθμιστικά γονίδια που ελέγχουν το φυλο-καθορισμό στη Drosophila melanogaster. Η λειτουργία του γονιδίου tra2 έχει δειχθεί να είναι απαραίτητη για το θηλυκό τρόπο συρραφής του γονιδίου doublesex, όπως και για τη φυσιολογική σπερματογένεση των αρσενικών της Drosophila. Ο φυλο-καθοριστικός ρόλος του γονιδίου tra2 στο B. oleae (Botra2) δοκιμάστηκε με RNA interference (RNAi) στο δεύτερο μέρος αυτής της διατριβής. Ένεση προ-βλαστοδερμικών εμβρύων του δάκου με αυξανόμενες συγκεντρώσεις δίκλωνου RNA του γονιδίου Botra2 οδήγησε σε αυξανόμενο αριθμό αρσενικών ατόμων και σε αντίστοιχη μείωση της γονιμότητας των XY αρσενικών, επιβεβαιώνοντας τη συντηρημένη λειτουργία του γονιδίου με το αντίστοιχο του της Drosophila. Βασιζόμενοι στα αποτελέσματα μας, σχεδιάσαμε και κατασκευάσαμε ένα φορέα μετασχηματισμού με τα άκρα του μεταθετού στοιχείου Minos, όπου η έκφραση μιας κασέτας αντίστροφα μεταγραφόμενων κωδικών περιοχών του γονιδίου tra2 είναι ρυθμιζόμενη. Το παραπάνω αποτελεί το τρίτο μέρος της παρούσας μελέτης. Εισαγωγή του συγκεκριμένου τρανσποζονίου στη γαμετική σειρά του B. oleae, θα οδηγήσει στη δημιουργία στελεχών, όπου όταν η έκφραση της κασέτας επάγεται, θα δίνει στείρα και αρσενικά μόνο έντομα, χρήσιμα για εφαρμογές SIT. (EL)
The olive fruit fly Bactrocera oleae (Dacus) is the most destructive pest of olives worldwide. There is increasing interest in biological methods for control of this species, in part because of worldwide awareness to the harmful effects of insecticides and other factors such as increasing insect resistance to existing insecticides. The Sterile Insect Technique (SIT) provides a new biological method for dealing with pests, with great application success in various parts of the world. It involves rearing large numbers of insects that are then sterilized before field release. Although equal numbers of the two sexes are initially produced, females are separated and discarded before release because are considered detrimental to control efforts. If sufficient numbers of competitive sterile males are released, the majority of the wild females in the field will mate with them and thus will not produce viable offspring. In this thesis, we have demonstrated stable and efficient transposase-mediated germ-line transformation of this insect with a Minos based EGFP expressing vector (Koukidou et al., 2006). Using Minos based transformation, we then started to develop a genetically engineered strain for SIT application, employing the sex determining gene transformer 2 (tra2). The tra2 gene is one of the regulatory genes that control sex determination in Drosophila melanogaster. The wild type function of tra2 has been shown to be required for female specific splicing of the doublesex gene as well as for normal spermatogenesis in male Drosophila. The sex determining role of B. oleae tra2 gene (Botra2) was assayed by RNA interference (RNAi) in the second part of the thesis. Injection of B. oleae pre-blastoderm embryos with increasing concentrations of Botra2 dsRNA resulted in an increased number of male flies and a corresponding decrease of XY male fertility, confirming the gene’s functional conservation to its Drosophila orthologue. Based on our RNAi results, as the third part of this thesis, we have developed a Minos based EGFP expressing plasmid, where tra2 expression is repressible. Introduction of this transposon into the germline of B. oleae should result in a strain that, when tra2 expression is induced, will give sterile, male-only progeny, useful for SIT applications. (EN)

text

Έλεγχος εντόμων
Insect Control
Genetics
Γενετική

Πανεπιστήμιο Κρήτης (EL)
University of Crete (EN)

2007-07-26




*Institutions are responsible for keeping their URLs functional (digital file, item page in repository site)