Ο προστάτης αδένας είναι ένα οπισθοπεριτοναϊκό όργανο που περιβάλλει τον αυχένα της κύστεως και την ουρήθρα. Η φυσιολογική του λειτουργία είναι η έκκριση του προστατικού υγρού, το οποίο είναι πλούσιο σε ηλεκτρολύτες και ένζυμα, με σκοπό την ενεργειακή υποστήριξη και την αύξηση της κινητικότητας των σπερματοζωαρίων. Η υπερπλασία του προστάτη είναι ο πιο συνήθης καλοήθης όγκος στους άντρες άνω των 60 ετών. Οι προτεινόμενοι μηχανισμοί εμφάνισης της ασθένειας είναι η συνεργατικότητα οιστρογόνων-ανδρογόνων, αλλά και η διαταραχή της ισορροπίας μεταξύ του ρυθμού απόπτωσης των προστατικών κυττάρων και του ρυθμού πολλαπλασιασμού τους, η οποία προκαλείται από ορμονικούς και αναπτυξιακούς παράγοντες καθώς και από ογκογονίδια. Ο καρκίνος του προστάτη είναι ο πιο συχνά εμφανιζόμενος καρκίνος μεταξύ των ανδρών και η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στους άνδρες μετά τον καρκίνο του πνεύμονα. Χαρακτηρίζεται από μοριακές και γενετικές αλλοιώσεις που προκαλούν γρήγορο κυτταρικό πολλαπλασιασμό και παρεμπόδιση του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου (απόπτωση). Αίτια εμφάνισης καρκίνου του προστάτη είναι η γενετική προδιάθεση, οι ενδογενείς ορμονικές διαταραχές, η έκθεση σε περιβαλλοντικά καρκινογόνα και οι σεξουαλικά μεταδιδόμενοι μολυσματικοί παράγοντες. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν να διερευνηθεί η εμπλοκή των πεπτιδικών παραγόντων αύξησης και των γονιδίων p53, Cyclin D1 και Tpl-2/Cot στη εμφάνιση τόσο της καλοήθους υπερπλασίας όσο και του καρκίνου του προστάτη. Για το σκοπό αυτό συλλέχθηκαν δείγματα ιστών από 40 ασθενείς με καρκίνο προστάτη, από 40 ασθενείς με προστατική υπερπλασία και από 10 φυσιολογικούς δότες. Στο πρώτο μέρος της διατριβής μελετήθηκε η έκφραση των πεπτιδικών παραγόντων αύξησης στον φυσιολογικό, υπερτροφικό και κακοήθη προστατικό αδένα. Οι πεπτιδικοί παράγοντες αύξησης είναι ρυθμιστικές πρωτεΐνες που συμμετέχουν στις λειτουργίες της κυτταρικής ανάπτυξης, διαφοροποίησης και θανάτου (απόπτωση). Αρκετές πρωτεΐνες ογκογονιδίων είναι στην πραγματικότητα πεπτιδικοί παράγοντες αύξησης ή υποδοχείς πεπτιδικών παραγόντων αύξησης. Οι παράγοντες που μελετήθηκαν ήταν οι FGF2 (επάγει τον πολλαπλασιασμό των επιθηλιακών και στρωματικών κυττάρων, και είναι ισχυρός παράγοντας αγγειογένεσης), EGF (παίζει σημαντικό ρόλο στην εμβρυογένεση, την κυτταρική διαφοροποίηση και την αγγειογένεση), TGFΒ1 (προάγει την αγγειογένεση και το σχηματισμό του εξωκυτταρικού μεσεγχύματος, καταστέλλει το ανοσοποιητικό σύστημα και ρυθμίζει την κυτταρική διαφοροποίηση), VEGF (επιδρά στη δημιουργία των αγγείων κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη καθώς και σε φυσιολογικές και καρκινικές καταστάσεις, δημιουργώντας όμως αγγεία με αυξημένη διαπερατότητα) και IGF1 (διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των στρωματικών και επιθηλιακών κυττάρων). Οι πεπτιδικοί παράγοντες αύξησης παίζουν σημαντικό ρόλο στη φυσιολογική προστατική ανάπτυξη και διαφοροποίηση, ενώ η παρουσία τους έχει επιβεβαιωθεί σε προστατικές κυτταρικές σειρές και όγκους. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι οι παράγοντες αύξησης VEGF, EGF και FGF2 υπερεκφράζονται στον καρκίνο του προστάτη, ενώ οι παράγοντες TGFB1 και IGF1 εμφανίζουν μειωμένη έκφραση. Στην προστατική υπερπλασία η έκφραση των παραγόντων FGF2 και EGF είναι σε φυσιολογικά επίπεδα, ενώ υποεκφράζονται οι παράγοντες VEGF, TGFB1 και IGF1. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων αποκάλυψε ότι όσοι ασθενείς με καρκίνο προστάτη έχουν υψηλά επίπεδα PSA στο αίμα τους υποεκφράζουν τον παράγοντα FGF2 (p=0.016). Επιπλέον, ασθενείς με καρκίνο χαμηλού Gleason score (<7) έχουν αυξημένα επίπεδα EGF (p=0.035) και IGF1 (p=0.031). Τα επίπεδα έκφρασης του IGF1 είναι επίσης αυξημένα σε καρκίνους πρώιμου σταδίου (T1-T2) (p=0.030). Στην υπερπλασία του προστάτη, οι γηραιότεροι ασθενείς έχουν μειωμένα επίπεδα EGF (p=0.018), ενώ οι νεώτεροι έχουν αυξημένα επίπεδα IGF1 (p-0.041). Επιπλέον η συν-έκφραση των πεπτιδικών παραγόντων αύξησης εμφανίζει μεγάλες διαφορές μεταξύ φυσιολογικού, υπερτροφικού και κακοήθους προστάτη. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώνουν τη συμμετοχή των παραγόντων VEGF, FGF2, TGFB1, EGF και IGF1 στη δημιουργία τόσο της υπερπλασίας όσο και του καρκίνου του προστάτη. Στο δεύτερο μέρος της διατριβής μελετήθηκαν τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων p53 και Cyclin D1, και έγινε συσχέτιση με σημαντικούς πολυμορφισμούς που αυτά φέρουν. Το ογκοκατασταλτικό γονίδιο p53 παίζει σημαντικό ρόλο σε μια πλειάδα ενδοκυτταρικών λειτουργιών, μεταξύ των οποίων είναι η αναστολή του κυτταρικού κύκλου, η επιδιόρθωση του DNA και η απόπτωση. Η σημασία του p53 είναι πολύ μεγάλη, εφόσον είναι μεταλλαγμένο σε >50% των ανθρώπινων νεοπλασιών. Το p53 έχει έναν πολυμορφισμό στο κωδικόνιο 72 (Pro σε Arg), ο οποίος αλλάζει τις βιοχημικές ιδιότητες της πρωτεΐνης. Τα αποτελέσματα των αναλύσεων μας έδειξαν ότι το p53 υπερεκφράζεται στον καρκίνο του προστάτη, ενώ τα επίπεδα του υποεκφράζονται στην προστατική υπερπλασία. Επιπρόσθετα, ο πολυμορφισμός Arg72Pro σχετίζεται με την εμφάνιση προστατικής υπερπλασίας (p=0.042) αλλά όχι με την εμφάνιση καρκίνου. Ωστόσο οι ασθενείς με καρκίνο του προστάτη που φέρουν το γονότυπο Arg/Arg εμφανίζουν αυξημένα επίπεδα έκφρασης του p53, σε σχέση με τους φορείς των υπολοίπων γονοτύπων. Η Cyclin D1 είναι μέλος της οικογένειας των G1 κυκλινών, οι οποίες ρυθμίζουν τον κυτταρικό κύκλο στη φάση G1 μέσω του μοριακού μονοπατιού της Rb. Το mRNA της υπόκειται εναλλακτικό μάτισμα, μια διαδικασία που ρυθμίζεται από έναν πολυμορφισμό (G870A) σε μια συντηρημένη περιοχή του εξωνίου 4. Η μελέτη μας έδειξε ότι η Cyclin D1 υπερεκφράζεται στον καρκίνο του προστάτη ενώ υποεκφράζεται στην προστατική υπερπλασία. Ο πολυμορφισμός G870A σχετίζεται με την εμφάνιση προστατικού αδενοκαρκινώματος (p=0.015) και μάλιστα σε νεότερη ηλικία (p=0.049), αλλά όχι και υπερπλασίας προστάτη. Αντιθέτως, τα επίπεδα έκφρασης της Cyclin D1 δεν επηρεάζονται από τον πολυμορφισμό αυτό. Από τα παραπάνω αποτελέσματα είναι φανερό πως τόσο η p53, όσο και η Cyclin D1, καθώς και οι πολυμορφισμοί τους, εμπλέκονται και στις δύο ασθένειες του προστάτη αδένα. Στο τρίτο μέρος της διατριβής εξετάσαμε την έκφραση της κινάσης Tpl-2/Cot. Το πρωτο-ογκογονίδιο Tpl-2/Cot κωδικοποιεί μια πρωτεϊνική κινάση σερίνης-θρεονίνης, η οποία ανήκει στις ΜΑΡΚ κινάσες. Ενεργοποιεί τις κινάσες Erl1/Erk2, JNK και p38MAPK σε διάφορες κυτταρικές σειρές και προάγει την απόπτωση μέσω των κασπασών 3 και 9. Επιπλέον, αυξάνει την έκφραση της ιντερλευκίνης 2 και του TNF-a, ενεργοποιώντας τους παράγοντες μεταγραφής NFAT και NFkB. Εκφράζεται στους περισσότερους φυσιολογικούς ιστούς σε χαμηλά επίπεδα, ενώ εμφανίζει υπερέκφραση σε διάφορους καρκίνους. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα των αναλύσεών μας, τα επίπεδα της έκφρασης του Tpl-2 ήταν υψηλότερα από τα φυσιολογικά στο 50% των καρκινικών δειγμάτων, ενώ αντιθέτως η έκφραση του Tpl-2 ήταν απορυθμισμένη στις καλοήθεις υπερπλασίες, αφού είχαμε υπερέκφρασή του στο 18% των δειγμάτων και υποέκφρασή του στο 37%. Η στατιστική ανάλυση αποκάλυψε ότι η υπερέκφραση του παρατηρήθηκε σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη κάτω των 70 ετών (p=0.019), ενώ στην καλοήθη υπερπλασία οι ασθενείς που εμφανίζουν υποέκφραση του Tpl-2 είναι κατά μέσο όρο 5 έτη μεγαλύτεροι από τους ασθενείς με φυσιολογική έκφραση (p=0.039). Από τα αποτελέσματα αυτά συμπεραίνουμε ότι η αύξηση της έκφρασης του Tpl-2 παίζει σημαντικό ρόλο στον καρκίνο του προστάτη και ότι σχετίζεται με πρώιμη έναρξη της νόσου. Επιπλέον η απορύθμιση της έκφρασης του Tpl-2 στα δείγματα με καλοήθη υπερπλασία μπορεί να αποτελεί μέρος ενός μηχανισμού μέσω του οποίου το προστατικό κύτταρο οδηγείται στην υπερπλασία. Τα αποτελέσματα της παρούσης διατριβής παρέχουν σοβαρές ενδείξεις για τη συμμετοχή των μελετηθέντων μορίων στην εμφάνιση της καλοήθους υπερπλασίας και του καρκίνου του προστάτη, ενώ θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν για την έγκαιρη διάγνωση, σωστή παρακολούθηση αλλά και θεραπεία των ασθενών.
(EL)
The prostate grand is retroperitoneal organ that surrounds the bladder neck and the urethra. Its function is the secretion of the prostatic fluid, which is rich in electrolytes and enzymes, in order to provide a source of energy for the spermatozoa and to increase their mobility. Benign prostatic hyperplasia is the most common benign tumor among men aged above 60. The suggested mechanisms that lead to the development of the disease are the co-operativity between estrogens and androgens and the disruption of the balance between the rate of proliferation and apoptosis of the prostate cells, which is caused by hormonal and developmental factors, as well as by oncogenes. Prostate cancer is the most frequent cancer among men and the second leading cause of death behind lung cancer. Its characteristics are molecular and genetic disorders that cause rapid cellular proliferation and inhibit apoptosis. Genetic background, hormonal disorders, exposure in environmental carcinogens and sexually transmitted diseases contribute significantly to the development of the disease. The subject of this thesis was to determine the role of peptide growth factors and the genes p53, Cyclin D1 και Tpl-2/Cot in the development of both benign and malignant prostatic diseases. For this cause we collected tissue samples from 40 patients with prostate adenocarcinoma, from 40 patients with benign prostatic hyperplasia and from 10 normal donors (collected post-mortem). In the first part of the thesis we studied the expression of peptide growth factors in normal, benign and malignant prostate. Peptide growth factors are regulatory proteins that participate in cellular growth, differentiation and apoptosis. Several oncogenes are in fact growth factors or growth factor receptors. The growth factors studied were: FGF2 (induces proliferation of epithelial and stromal cells and is a powerful angiogenic factor), EGF (its role is important in embryogenesis, in cellular differentiation and in angiogenesis), TGFΒ1 (induces angiogenesis and the formation of the extracellular matrix, represses the immune system and regulates cellular differentiation), VEGF (is involved in the formation of new blood vessels during embryonic development and various other normal and malignant conditions, forming vessels with increased permeability) και IGF1 (induces the proliferation of stromal and epithelial cells). Peptide growth factors are important in normal prostatic development and differentiation, while their presence has been confirmed in prostate cell lines and tumors. Our results showed that growth factors VEGF, EGF and FGF2 are overexpressed in prostate cancer, while growth factors TGFB1 and IGF1 have reduced expression. In prostatic hyperplasia the expression of growth factors FGF2 and EGF is normal, while mRNA downregulation was observed in growth factors VEGF, TGFB1 and IGF1. Statistical analysis revealed that prostate cancer patients with high PSA blood levels downregulate FGF2 (p=0.016). Additionally, cancer patients with low Gleason score (<7) have increased EGF (p=0.035) and IGF1 (p=0.031) mRNA levels. IGF1 levels are also increased in early stage cancers (T1-T2) (p=0.030). In benign prostatic hyperplasia, elder patients have reduced EGF levels (p=0.018), while younger patients overexpress IGF1 (p-0.041). Finally, the co-expression pattern of all five studied peptide growth factors exhibits differences among normal, benign and malignant prostate. These results verify the involvement of growth factors VEGF, FGF2, TGFB1, EGF και IGF1 in the development of benign prostatic hyperplasia and prostate cancer. In the second part of the thesis we studied the expression levels of the genes p53 and Cyclin D1, and correlated their expression with important polymorphisms that these two genes carry. p53 oncosupressor gene is important in several intracellular procedures, including cell cycle arrest, DNA repair and apoptosis. Its importance is great, considering the fact that it is mutated in >50% of human malignancies. p53 has a common polymorphism in codon 72 (Pro to Arg), which alters the biochemical properties of the protein. Our results showed that p53 is overexpressed in prostate cancer, while its levels are downregulated in prostatic hyperplasia. Moreover, the Arg72Pro polymorphism is associated with the development of benign prostatic hyperplasia (p=0.042), but not of prostate cancer. However, patients with prostate cancer that carry the Arg/Arg codon 72 genotype have higher p53 mRNA levels than patients with the other two polymorphic genotypes. Cyclin D1 is a member of the G1 cyclin family, that regulate cell cycle in G1 phase through the molecular pathway of Rb. CCND1 mRNA is alternatively spliced, a procedure that is regulated by a polymorphism (G870A) in a conserved region of exon 4. Our study showed that cyclin D1 is overexpressed in prostate cancer, while it is downregulated in benign prostatic hyperplasia. G870A polymorphism is associated with the development of prostate carcinogenesis (p=0.015), and with early disease onset (p=0.049), but not with the development of prostatic hyperplasia. On the contrary, cyclin D1 expression levels are not affected by the status of the G87A polymorphism. From the above results it is obvious that both p53 and cyclin D1, and their polymorphisms, are implicated in the development of both prostatic disorders. In the second part of the thesis we examined the expression of Tpl-2/Cot kinase. Tpl-2/Cot protooncogene encodes an serine-threonine kinase that is a member of the ΜΑΡΚ family. It activates Erl1/Erk2, JNK and p38MAPK kinases in various cell lines and induces apoptosis through caspases 3 and 9. It also increases the expression of interleukin-2 and TNF-a, activation nuclear transcription factors NFAT and NFkB. Tpl-2/Cot is expressed in most normal tissues in low levels, while it is overexpressed in various malignancies. According to our results, Tpl-2 mRNA were higher in 50% of cancer samples, while its expression was deregulated in benign hyperplasias, since it was overexpressed in 18% of samples and downregulated in 37%. Statistical analysis revealed that Tpl-2 overexpression is observed in prostate cancer patients with age <70 years (p=0.019), while in benign prostatic hyperplasia patients that downregulate Tpl-2 are on average 5 years older that patients with normal Tpl-2 expression (p=0.039). From these results we conclude that Tpl-2 overexpression plays an important role in the development of prostate cancer and contributes to early disease onset. Additionally, deregulation of Tpl-2 expression in benign prostatic hyperplasia samples could be a part of a mechanism by which the prostate cell is lead to hyperplasia. The results of this thesis provide concrete evidence for the involvement of the studied molecules in the development of benign prostatic hyperplasia and prostate cancer, while they could be utilized for early disease diagnosis, correct patient monitoring and treatment.
(EN)
