Η υγιεινή και ασφάλεια τροφίμων είναι ζητήματα που αφορούν όλους μας. Κάθε χρόνο, ανά την υφήλιο παρατηρούνται κρούσματα ασθενειών που οφείλονται σε μολύνσεις τροφίμων και τα οποία μπορεί να οφείλονται σε κακή διαχείρηση αυτών των τροφών κατά την παραγωγή, παρασκευή, συσκευασία ή ακόμα και το μαγείρεμα. Παρόλο που οι έλεγχοι για τις συνθήκες υγιεινής γίνονται όλο και αυστηρότεροι, κρούσματα συνεχίζουν να παρατηρούνται όταν οι συνθήκες για συντήρηση και επεξεργασία τροφίμων δεν τηρούνται ή δεν υφίσταται η απαιτούμενη προσοχή. Τα φαινόμενα αυτά γίνονται πιο έντονα σε χώρες του τρίτου κόσμου όπου οι πόροι και οι δυνατότητες για να εφαρμοστούν τα απαιτούμενα μέτρα είναι περιορισμένοι. Είναι ευκόλως εννοούμενο ότι περιστατικά που οφείλονται σε κακή ποιότητα τροφίμων έχουν πολυδιάστατες συνέπειες. Η πιο σημαντική συνιστώσα είναι η ανθρώπινη και δημόσια υγεία, καθώς μολυσμένα τρόφιμα μπορεί να οδηγήσουν σε λιγότερο ή περισσότερο σοβαρές ασθένειες, ακόμη και στο θάνατο. Επίσης, είναι πιθανή η διάδοση ασθενειών που οφείλονται σε μολυσμένα τρόφιμα και σε άλλες περιοχές του πλανήτη εφόσον αυτά εξάγονται εμπορικά. Το κόστος δεν περιορίζεται μόνο στις ανθρώπινες ζωές, αλλά επεκτείνεται και σε τεράστια έξοδα για ιατροφαρμακευτική περίθαλψη, μειωμένη εμπιστοσύνη του καταναλωτή προς τους παραγωγούς τροφίμων και κατ’ επέκταση ισχυρά πλήγματα στην οικονομία του τομέα και στο εμπόριο.
Είναι κοινώς αποδεκτό ότι η συντριπτική πλειοψηφία των ασθενειών που σχετίζονται με μολυσμένα τρόφιμα οφείλονται σε βακτήρια, τα πιο σημαντικά από τα οποία είναι τα Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus όπως και μέλη του γένους βακτηρίων Salmonella. Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι για τις ασθένειες τροφίμων στην πραγματικότητα υπεύθυνα είναι περίπου 20 είδη βακτηρίων, παρά το γεγονός ότι το 90% ή και παραπάνω των ασθενειών αυτών οφείλονται σε βακτήρια.
Κατά συνέπεια, προκειμένου να διασφαλιστεί η υγεία των καταναλωτών και για να αποφευχθούν σημαντικές οικονομικές απώλειες, είναι σημαντικός ο έλεγχος των τροφίμων.
Στην παρούσα εργασία έγινε μια προσπάθεια ανίχνευσης του παθογόνου Salmonella enterica οροτύπου Typhimurium, χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικές μεθόδους πολλαπλασιασμού DNA, την ευρέως διαδεδομένη PCR (Polymerase Chain Reaction) και την ισόθερμη μέθοδο RCA (Rolling Circle Amplification). Στόχος ήταν ο πολλαπλασιασμός DNA του βακτηρίου εφόσον αυτό υπήρχε, σε δείγματα γάλακτος. Η ανίχνευση πραγματοποιήθηκε με χρήση ακουστικού βιοαισθητήρα τύπου SAW (Surface Acoustic Waves), οι οποίοι εκτός από την ευαισθησία τους και τη δυνατότητα ανίχνευσης χωρίς δείκτες (label-free), έχουν τη δυνατότητα να συνδυαστούν με συστήματα μικροροής (microfluidic systems), για την κατασκευή φορητών πλατφόρμων Lab-on-Chip (LoC). Αυτές οι πλατφόρμες αναμένεται να προσφέρουν δυνατότητες, όπως ταχύτητα και οικονομία, παράλληλη επεξεργασία πολλαπλών δειγμάτων, μεγάλη ευαισθησία ανίχνευσης, ενώ δεν έχουν την απαίτηση ακριβού εξοπλισμού και χώρου εργασίας, όπως και την παρουσία εξειδικευμένου ανθρώπινου δυναμικού. Ένα ακόμα πλεονέκτημα είναι ότι η προσέγγιση που ακολουθήθηκε δεν απαιτούσε περαιτέρω επεξεργασία των δειγμάτων μετά τη συλλογή τους, όπως καλλιέργεια των βακτηρίων, μειώνοντας έτσι το χρόνο, το κόστος και την τεχνική κατάρτιση που απαιτούν οι συμβατικές μέθοδοι ανίχνευσης μικροοργανισμών.
Αν και στην παρούσα φάση, στην πλειοψηφία των περιπτώσεων, δε χρησιμοποιήθηκαν βακτήρια, αλλά απομονωμένο γενωμικό υλικό από αυτά, υπάρχει η δυνατότητα χρήσης τους απευθείας μετά από μια απλή θέρμανση του δείγματος, ώστε να επέλθει κυτταρική λύση. Στη συνέχεια δοκιμάστηκαν τόσο η PCR όσο και η RCA για τον πολλαπλασιασμό γονιδίου/γονιδίων ενδιαφέροντος και έπειτα ακολούθησε απευθείας ανίχνευση μέσω του βιοαισθητήρα χωρίς επιπλέον επεξεργασία, όπως καθαρισμός. Τα αποτελέσματα ήταν κάτι παραπάνω από υποσχόμενα. Οι δύο μέθοδοι έδωσαν πολύ ικανοποιητικά όρια ανίχνευσης (5 κύτταρα/δείγμα για την PCR και 100 κύτταρα/δείγμα για την RCA έως την παρούσα φάση), συνιστώντας ότι η προσέγγισή μας δεν υπολείπεται σε τίποτα των κλασσικών μεθόδων. Έπειτα, έγινε σύγκριση των δύο μεθόδων ως προς διάφορες παραμέτρους (ευκολία, απαιτήσεις σε υλικά και εξοπλισμό, ταχύτητα, ευαισθησία κλπ) και πρόταση επιλογής μιας εκ των δύο για εφαρμογή σε πλατφόρμα Lab-on-Chip (LoC). Να αναφερθεί ότι στα χρονικά πλαίσια μιας διπλωματικής διατριβής (1 έτος), έγινε κάθε δυνατή προσπάθεια για βελτιστοποίηση των μεθόδων και ειδικά της RCA, για να υπάρξει κάποιο καταληκτικό πρωτόκολλο. Αν και η πρόοδος που έγινε ήταν ικανοποιητική, η όλη διαδικασία επιδέχεται βελτίωσης. Απαιτείται επιπλέον χρόνος για βελτιστοποίηση της μεθόδου, τόσο στην παρασκευή και εφαρμογή της, όσο και στην κατάληξη για την αποτελεσματικότητά της (απαιτούμενος χρόνος, απόδοση σε προϊόν, όριο ανίχνευσης, μείωση κόστους κλπ).
Καθ’ όλη την έκταση της παρούσας εργασίας, ευελπιστώ ότι θα καταστεί σαφές ότι η εφαρμογή αναδυόμενων τεχνολογιών, όπως τα συστήματα μικροροής και οι ακουστικοί βιοαισθητήρες συνδυαζόμενες με πιο κλασσικές μεθόδους όπως η PCR ή η RCA για την κατασκευή πλατφόρμων LoC, μπορούν να προσφέρουν πολλά πλεονεκτήματα, όπως αυξημένη ευαισθησία, μείωση του κόστους, παράλληλη και γρήγορη επεξεργασία δειγμάτων σε πολλές εφαρμογές με μεγάλο ενδιαφέρον, όπως η διάγνωση ασθενειών και η ασφάλεια τροφίμων.
(EL)
Food hygiene and safety are matters of significant importance to everyone. Annually, foodborne diseases are reported in a worldwide scale. Sources of the aforementioned diseases may be inappropriate handling during production, preparation, packaging or even food cooking. Although controls become increasingly stricter, cases are still reported due to ineffective food maintenance and handling. These phenomena are more intense to third world countries, where resources and the ability to follow the necessary regulations are not abundant. Apparently, low quality food has numerous consequences. The most important aspect is human and public health, since contaminated food may lead to more or less serious diseases, or even death. Moreover, disease spreading also poses a threat in case the contaminated food is commercially exported to other regions of the planet. The damage is not restricted to human lives though; it expands to overwhelming expenses for medical and clinical treatment, a very negative impact of the consumers’ trust towards the producer and can in consequence wreak havoc on the field’s economy and trading.
It is widely accepted that the vast majority of foodborne diseases is directly related to bacteria. The most important candidates are Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, as well as members of the Salmonella genus. It is noteworthy however, that only about 20 bacteria species are responsible for most foodborne diseases, although that percentage is 90% or even higher.
As a result, to protect consumers’ health and avoid significant financial casualties, food safety control is imperative.
In the present work, we tried to detect the pathogen Salmonella enterica serovar Typhimurium, applying two different DNA amplification methods, the well-established PCR (Polymerase Chain Reaction), and the isothermal RCA (Rolling Circle Amplification). The aim was bacteria DNA amplification in milk samples, if it indeed existed. Detection was conducted using an acoustic SAW (Surface Acoustic Waves) Biosensor, which apart from its sensitivity and label-free detection potential, gives the option of combination with microfluidic systems to form integrated Lab-on-Chip (LoC) platforms. These platforms are expected to offer many features like speed and reduction in cost, testing of multiple samples in parallel, great detection sensitivity, avoiding the demand of expensive equipment and workspace, as well as the need of specialized and skilled personnel. Another advantage is that our method required no additional sample treatment, like bacteria culture, after the samples have been collected, reducing the time, cost and technical training conventional methods require.
Even though at this stage, in most cases, bacterial genomic DNA was used instead of actual bacteria, it is still possible to use them directly, after heating the sample to inflict thermal lysis. PCR and RCA were both tested for the amplification of a gene(s) of interest followed by direct detection with no further sample treatment like DNA clean-up. The results were promising as both amplification methods offered satisfactory detection limits (5cells/sample for PCR and 100cells/sample for RCA up to the current phase), implying our approach lacks nothing when compared to classic methodologies. The two methods were then compared in terms of simplicity, reagent and equipment requirements, speed, sensitivity etc. and then an effort of suggesting which of the two is more suitable to be used in Lab-on-Chip (LoC) platforms was made. It is important to note that during the time offered for a master diploma thesis (1 year), every possible effort was made to optimize the methods and especially RCA, in order to reach a conclusive protocol. Although the progress was satisfactory, there is still room for improvement. More time is needed for the method optimization, not only for its’ preparation and application, but also to conclude about its’ effectiveness (required time, product yield, detection limit, cost reduction etc.).
Throughout this thesis, I hope it will be made clear that application of rising technologies, such as microfluidic systems and acoustic biosensors, coupled with more traditional methods like PCR and RCA for the construction of LoC platforms, can offer many advantages, like increased sensitivity, cost-effective methods and parallel and rapid sample treatment for applications of great interest, such as diagnostics and food safety control.
(EN)
