Η Χρόνια Αποφρακτική Πνευμονοπάθεια (Χ.Α.Π.) αποτελεί μια από τις σημαντικότερες αιτίες νοσηρότητας και θνησιμότητας παγκοσμίως. Όπως έχει διαπιστωθεί μέχρι τώρα από πολλές μελέτες, το κάπνισμα του τσιγάρου αντιπροσωπεύει τον κυριότερο παράγοντα κινδύνου για την ανάπτυξη της Χ.Α.Π. Φαίνεται όμως ότι υπάρχει αξιοσημείωτη ατομική διαφοροποίηση όσον αφορά την απάντηση στην έκθεση του καπνού του τσιγάρου, αφού τελικά λιγότερο από 20% των καπνιστών αναπτύσουν Χρόνια Αποφρακτική Πνευμονοπάθεια. Αυτό υποδεικνύει ότι επιπλέον γενετικοί και περιβαλλοντολογικοί παράγοντες φαίνεται να ευθύνονται για την ανάπτυξη της νόσου. Αν και μέχρι τώρα πολλές κλινικές μελέτες σχετίζονται με την παθοφυσιολογία της Χ.Α.Π., εντούτοις ελάχιστα γνωρίζουμε για την μοριακή βάση της ασθένειας. Το Μικροδορυφορικό DNA αποτελείται από βραχείες διαδοχικά επαναλαμβανόμενες νουκλεοτιδικές αλληλουχίες και βρίσκεται διασκορπισμένο σε όλο το γονιδίωμα των ανώτερων ευκαρυωτικών οργανισμών, ενώ υπάρχει σε περισσότερες από 100.000 διαφορετικές θέσεις σε όλα τα χρωμοσώματα του ανθρώπου. Το φαινόμενο της Αστάθειας τoυ Μικροδορυφορικού DNA (MICROSATELLITE INSTABILITY, MI) έχει συνδεθεί με υψηλή συχνότητα μεταλλάξεων και αποτελεί κοινό εύρημα στους περισσότερους καρκίνους. Στην περίπτωση της Χρόνιας Αποφρακτικής Πνευμονοπάθειας, από τις μέχρι σήμερα γνωστές βιβλιογραφικές αναφορές, δεν έχει επιχειρηθεί η ανίχνευση του φαινομένου της Αστάθειας του Μικροδορυφορικού DNA. Το Πρώτο Πρωτόκολλο της μελέτης μας, σκοπό είχε να διερευνήσει την πιθανότητα ανίχνευσης του φαινομένου της Αστάθειας του Μικροδορυφορικού DNA σε κυτταρολογικά δείγματα (πτύελα) ασθενών με Χρόνια Αποφρακτική Πνευμονοπάθεια και να εκτιμηθεί η περαιτέρω πιθανότητα διερεύνησης γενετικών διαταραχών στους ασθενείς με Χ.Α.Π., χρησιμοποιώντας σαν δείκτη Αστάθειας. Δείγματα (πτύελα και περιφερικό αίμα) από τριάντα-ένα (31) ασθενείς με Χ.Α.Π. αναλύθηκαν. Έξι δείκτες του Μικροδορυφορικού DNA (Microsatellite markers) χρησιμοποιήθηκαν, για τέσσερα διαφορετικά χρωμοσώματα Η Αστάθεια των την συχνότητα εμφάνισης του φαινομένου της μικροδορυφορικών αλληλουχιών, ανιχνεύθηκε συγκρίνοντας το ηλεκτροφορητικό μοντέλο των δεικτών του Μικροδορυφορικού DNA που ενισχύθηκαν με την μέθοδο της Αλυσιδωτής Αντίδρασης με Πολυμεράση (PCR), στα δυο διαφορετικά δείγματα DNA που χρησιμοποιήθηκαν από τον κάθε ασθενή, και τα οποία αντιστοιχούσαν στο DNA από το περιφερικό αίμα και στο DNA από το κυτταρολογικό δείγμα (πτύελα). Αστάθεια του Μικροδορυφορικού DNA χαρακτηρίστηκε κάθε διαφορά στην κινητικότητα των μικροδορυφορικών αλληλομόρφων, πάνω στην πηκτή του πολυακρυλαμιδίου κατά την ηλεκτροφόρηση, όπως ακόμα και η δημιουργία νέων αλληλομόρφων (novel alleles). Το DNA που εκχειλίστηκε από το περιφερικό αίμα θεωρήθηκε το φυσιολογικό πρότυπο για το γονιδιακό DNA, ενώ το DNA που προήλθε από τα πτύελα, ελέγχθηκε για την έκφραση του φαινομένου της αστάθειας των μικροδορυφορικών αλληλουχιών. Από τις τριάντα-ένα (31) περιπτώσεις που μελετήθηκαν επτά (7), δηλαδή ποσοστό 23% εμφάνισαν Αστάθεια του Μικροδορυφορικού DNA. Στις πέντε (5), από τις επτά (7) θετικές περιπτώσεις, Αστάθεια ανιχνεύθηκε μόνο σε ένα μικροδορυφορικό δείκτη, ενώ στις υπόλοιπες δύο (2) θετικές περιπτώσεις η αστάθεια αφορούσε δύο μικροδορυφορικούς δείκτες. Για να διαπιστωθεί αν η εμφάνιση του φαινομένου της Αστάθειας του Μικροδορυφορικού DNA, αποτελεί και δείκτη βαρύτητας της νόσου, συγκρίθηκαν κλινικοί και εργαστηριακοί παράμετροι των ασθενών που εμφάνισαν το φαινόμενο με αυτούς που ήταν αρνητικοί, χωρίς όμως να παρατηρηθούν στατιστικά σημαντικές διαφορές όσον αφορά την ηλικία, την καπνιστική συνήθεια, τα σπιρομετρικά ευρήματα ανάμεσα στις δύο υποομάδες. Έτσι θεωρήθηκε ότι το φαινόμενο της Αστάθειας αποτελεί ανιχνεύσιμη γενετική αλλοίωση σε κυτταρολογικά δείγματα ασθενών με Χρόνια Αποφρακτική Πνευμονοπάθεια και μπορεί να αντιπροσωπεύει δείκτη πιθανής κακοήθειας, ή δείκτη γενετικής διαταραχής που σχετίζεται με την εκδήλωση της νόσου. Όμως ο σχεδιασμός της προηγούμενης μελέτης δεν μας επέτρεψε να απαντήσουμε και να καταλήξουμε σε συμπεράσματα, αφού η παρακολούθηση των ασθενών δεν έγινε για μακρό χρονικό διάστημα και επιπλέον δεν έγινε σύγκριση με καπνιστές, χωρίς κλινικά ή σπιρομετρικά ευρήματα Χ.Α.Π. Έτσι, το Δεύτερο Πρωτόκολλο σχεδιάστηκε για να μελετηθεί η πιθανότητα ανίχνευσης του φαινόμενου της Αστάθειας των Μικροδορυφορικών Αλληλουχιών του DNA, σε καπνιστές με Χρόνια Αποφρακτική Πνευμονοπάθεια (Καπνιστές με Χ.Α.Π.), και σε καπνιστές που δεν εμφάνιζαν κλινικά ή σπιρομετρικά ευρήματα της νόσου (Καπνιστές χωρίς Χ.Α.Π.). Η Υπόθεση που τέθηκε, ήταν ότι αν το φαινόμενο της Αστάθειας, αποτελεί δείκτη δυνητικής κακοήθειας, τότε θα πρέπει να ανιχνεύεται και στους καπνιστές με Χ.Α.Π., αλλά και στους καπνιστές χωρίς εκδήλωση της νόσου. Από την άλλη πλευρά, αν το φαινόμενο της Αστάθειας αποτελεί γενετική ανωμαλία που οδηγεί στην ανάπτυξη της Χ.Α.Π., τότε θα πρέπει να ανιχνεύεται, κατά κύριο λόγο στους ασθενείς με Χρόνια Αποφρακτική Πνευμονοπάθεια, εξηγώντας κατά ένα μέρος την πολύπλοκη γενετική βάση της νόσου. Επτά υψηλά πολυμορφικοί μικροδορυφορικοί δείκτες χρησιμοποιήθηκαν για τα ίδια χρωμοσώματα που ερευνήθηκαν και στο πρώτο πρωτόκολλο ακολουθώντας την ίδια μέθοδο. Δείγματα (πτύελα και περιφερικό αίμα), από εξήντα (60) καπνιστές χωρίς Χ.Α.Π. και πενήντα εννέα (59) καπνιστές με σοβαρού βαθμού Χ.Α.Π. και παρόμοιο ιστορικό καπνίσματος 48 ±25 και 54 ± 33 (x ± SD) pack years (πακέτα επί έτη) αντίστοιχα, αναλύθηκαν. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε μία φορά για τους "μη-Χ.Α.Π. καπνιστές" και δύο φορές για τους "Χ.Α.Π.-καπνιστές", στην αρχή, και 24 μήνες αργότερα. Αστάθεια του Μικροδορυφορικού DNA ανιχνεύθηκε σε 14 καπνιστές με Χ.Α.Π., δηλαδή σε ποσοστό 24%, ενώ αντίθετα κανένας από τους καπνιστές χωρίς Χ.Α.Π. δεν εμφάνισε το φαινόμενο. Στις 10 από τις 14 θετικές περιπτώσεις ένας μόνο μικροδορυφορικός DNA δείκτης εμφάνισε το φαινόμενο, ενώ στις υπόλοιπες 4 θετικές περιπτώσεις Αστάθεια εκδηλώθηκε, σε δύο διαφορετικούς μικροδορυφορικούς δείκτες. Προκειμένου να διερευνηθεί η σχέση του φαινομένου της Αστάθειας με την βαρύτητα της νόσου, συγκρίθηκαν κλινικοί και εργαστηριακοί παράμετροι των ασθενών που εμφάνισαν το φαινόμενο με αυτούς που ήταν αρνητικοί, χωρίς όμως να παρατηρηθούν στατιστικά σημαντικές διαφορές στην ηλικία, στην επιβίωση, στα σπιρομετρικά ευρήματα, στην θεραπευτική αγωγή, στην καπνιστική συνήθεια και στη συχνότητα ανάπτυξης καρκίνου του πνεύμονα, ανάμεσα στις δύο ομάδες. Συμπερασματικά, από την παρούσα μελέτη, αποδεικνύεται ότι το φαινόμενο της Αστάθειας του Μικροδορυφορικού DNA αποτελεί κοινό εύρημα αποκλειστικά στους καπνιστές με Χρόνια Αποφρακτική Πνευμονοπάθεια αφού ανεβρέθηκε σε ποσοστό 24% στα κυτταρολογικά τους δείγματα, ενώ αντίθετα κανένας καπνιστής χωρίς Χ.Α.Π. δεν εμφάνισε το φαινόμενο. Τα αποτελέσματα αυτά στηρίζουν την υπόθεση ότι η Αστάθεια των Μικροδορυφορικών αλληλουχιών του DNA μπορεί να σχετίζεται με την πολύπλοκη γενετική βάση της Χρόνιας Αποφρακτικής Πνευμονοπάθειας. Επιπλέον, η αστάθεια αυτή θα μπορούσε να αποτελέσει δείκτη γενετικής διαταραχής που σχετίζεται με το κάπνισμα του τσιγάρου και μπορεί να οδηγήσει περαιτέρω στην ανάπτυξη της Χ.Α.Π.
(EL)
Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) is a leading cause of morbidity and mortality among the adult population worldwide. The major risk factor of COPD is undoubtedly cigarette smoking. However, only less than 20% of smokers develop clinically significant COPD. Thus, in addition to exposure, host factors are important in determining whether smokers develop lung disease. It has not been established if these susceptible smokers who develop COPD are genetically predetermined, or environmental (type of tobacco), dietary or other factors affect the development of the disease. Although several clinical studies exist on the pathophysiology of COPD, little is known as regards the molecular basis of the disease. Microsatellite DNA, is very short tandem nucleotide repeats and are found scattered throughout the human genome. Instability of tandem repeat DNA sequences or Microsatellite Instability (MI) has been correlated with high mutational rates and has been reported in various malignancies. In the first protocol of this study, we tried to investigate if Microsatellite DNA Instability (MI) is a detectable phenomenon in sputum cells of COPD patients and to perform an assessment of the mutational rate in those patients, as reflected by the incidence of Microsatellite Instability. Thirty-one cytological specimens from patients with COPD were analysed for Microsatellite Instability (MI). Polymerase Chain Reaction (PCR) coupled with assessment of electophoretic mobility of the amplified DNA fragments was employed to detect any irregularities in the generated pattern for each of the subjects. Six polymorphic microsatellite markers were targeted by utilizing specific oligonucleotide primer pairs for each of them. Genomic DNA isolated from sputum and blood samples from the subjects was used as template. The electophoretic pattern of each specimen was compared with the corresponding pattern of the peripheral blood and any difference in the mobility of the microsatellite alleles was interpreted as MI. Among 31 cases tested, 7 (23%) were interpreted as MI positive. In the 5 of these cases instability affected only one marker while in the remaining 2 cases, 2 markers were affected. It was postulated that MI is either a marker of potential malignancy or a genetic defect requirement for development of COPD. However, the design of the first protocol did not allow us to come to conclusions since we did not follow up the patients long enough or we did not compare them with non-COPD smokers. The second protocol was designed to study MI in smokers who develop COPD and those who do not. The hypothesis was that, if MI is a potential marker of malignancy, this marker should be rather evenly distributed among non-COPD smokers and COPD patients whereas, if this is a genetic alteration leading to COPD it would be more common in COPD patients. In order to investigate this hypothesis we compared smokers who develop COPD with smokers who did not (non-COPD). Seven highly polymorphic microsatellite markers were targeted on the DNA of sputum cells and of white blood cells. Sixty non-COPD smokers and 59 severe COPD patients with similar smoking history (mean ± SD) of 48±25 vs. 54±33 pack-years, respectively (p = 0.77) were studied. Non-COPD smokers were tested once and COPD-smokers were tested twice, with an interval of 24 months between tests. MI was detected in 14 COPD patients (24%) but in none of the non-COPD smokers. In 10 COPD patients MI positive instability was exhibited by one MI marker and in the remaining 4 by two different alleles. The most commonly affected marker was THRA1 on chromosome 17 (43%). No significant differences were found in the clinical or laboratory parameters, survival and in the development of lung cancer between MI positive and negative COPD patients, the revealed instability cannot be linked to the severity of the disease or previous smoking history. No change in the microsatellite alleles was found between the two tests made at interval of 24 months. Conclusions: This study demonstrated that MI was found exclusively in sputum cells of smokers with COPD. The results support the hypothesis that MI could be part of the complex genetic basis of COPD, and could be a marker of genetic susceptibility to cigarette smoking in order to develop COPD. To the best of our knowledge this is the first report of such a genetic alteration in smokers with COPD.
(EN)
