This item is provided by the institution :

Repository :
E-Locus Institutional Repository
see the original item page
in the repository's web site and access all digital files if the item*

2009 (EN)
Μελέτη της HRPA από το τύπου ΙΙΙ εκκριτικό σύστημα του φυτοπαθογόνου Pseudomonas syringae Pv. phaseolicola.
Study of HRPA from type III secration system of Pseudomonas syringae Pv. phaseolicola.

Γκουγκουλιά, Ειρήνη

Κοκκινίδης, Μιχαήλ

Αντικείμενο της παρούσας μεταπτυχιακής εργασίας είναι η μελέτη δυο μεταλλαγμάτων της πρωτεΐνης HrpA από το φυτοπαθογόνο Pseudomonas syringae pv. phaseolicola. H HrpA, η οποία είναι πιλίνη της Pseudomonas syringae, είναι μια μικρή υδροφιλική πρωτεΐνη που κωδικοποιείται από το γονίδιο hrpA. Λαμβάνοντας υπόψιν ότι το καρβοξυτελικό άκρο της θεωρείται υπεύθυνο για τον πολυμερισμό της καθώς και τον αμφιπαθητικό χαρακτήρα της καρβοξυτελικής προβλεπόμενης α έλικας της HrpA από P. syringae pv. phaseolicola, σχεδιάστηκαν δυο γονιδιακές κατασκευές με 8 και 18 υπολειπόμενα αμινοξικά κατάλοιπα (HrpAΔC8, HrpAΔC18, αντίστοιχα), προκειμένου να αποφευχθεί αυθόρμητος πολυμερισμός, ο οποίος θα εμπόδιζε τη κρυστάλλωση τους. Τα δυο αυτά μεταλλάγματα υπερεκφράστηκαν και απομονώθηκαν με χρωματογραφία συγγένειας και στη συνέχεια με χρωματογραφία μοριακής διήθησης. Επιπλέον, μελέτη της δευτεροταγούς δομής τους σε διαφορετικές συνθήκες θερμοκρασίας, συγκέντρωσης και pH, πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια του κυκλικού διχρωισμού. Σύμφωνα με την ανάλυση δεδομένων κυκλικού διχρωισμού, υπάρχει ένα πολύ μικρό προβλεπόμενο ποσοστό α-έλικας (10 %), ενώ τα προβλεπόμενα ποσοστά των β-πτυχωτών και τυχαίου σπειράματος είναι παρόμοια (20-30 %), ανεξάρτητα από τις διαφορετικές συνθήκες που δοκιμάστηκαν κάτι που έρχεται σε αντίθεση με την πρόβλεψη της δευτεροταγούς δομής με τη βοήθεια του αλγόριθμου PSIPRED. Παράλληλα, έγιναν πειράματα θερμοεπαγόμενης αποδιάταξης των μεταλλαγμάτων, τα οποία έρχονται σε αντίθεση με τη θεωρία της εύπλαστης σφαίρας για την πρωτεϊνική αναδίπλωση. Επιχειρήθηκε προκαταρκτική δομική μελέτη με τη μέθοδο σκέδασης ακτίνων Χ από διάλυμα σε μικρές γωνίες, ωστόσο οι μετρήσεις δεν ήταν επαρκείς ώστε να αποδώσουν τρισδιάστατα μοντέλα των μεταλλαγμάτων. Τέλος, οι υπό μελέτη πρωτεΐνες ελέγχθηκαν για την ικανότητα τους στην παραγωγή κρυστάλλων με διαφορετικές τεχνικές, και σε ποικίλες συνθήκες. (EL)
The subject of this master thesis is the study of two deleted mutants of the HrpA protein from the plant pathogenic bacterium Pseudomonas syringae pv. phaseolicola. HrpA, which is the pilin of the Pseudomonas syringae, is a small hydrophilic protein. Taking under consideration that the carboxy-terminal part of the protein is responsible for its polymerization and also the amphipathic profile of the carboxy-predicted α-helix of the HrpA from the P. syringae pv. phaseolicola, two constructs with the last 8 and 18 residues deleted were produced, in order to avoid any spontaneous polymerization, which could prevent crystallization. Both of the mutant proteins were overexpressed and purified by affinity chromatography and size exclusion chromatography. Moreover, study of the secondary structure of both mutants took place under different conditions of temperature, concentration and pH with CD. According to the CD data analysis, there is not high predicted percentage of α-helix (10 %), while the predicted percentages of β-strand and random coil are similar (20-30%) under different conditions, which is contrary to PSIPRED results. In addition to this, thermal denaturation experiments took place for both mutant proteins, which are just the opposite of the molten globule hypothesis for protein folding. Primary structural studies were attempted with the method of SAXS, but the original data were not sufficient to give 3D models of the mutant proteins. Finally, crystallization was attempted with different methods and under various conditions without the desired diffracted crystals. (EN)

Τύπος Εργασίας--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης




Σχολή/Τμήμα--Σχολή Θετικών και Τεχνολογικών Επιστημών--Τμήμα Βιολογίας--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης

*Institutions are responsible for keeping their URLs functional (digital file, item page in repository site)