Phenotypic and molecular characterization of micrometastatic cells of patients with breast cancer

RDF 

 
This item is provided by the institution :
University of Crete
Repository :
E-Locus Institutional Repository
see the original item page
in the repository's web site and access all digital files if the item*
share



Semantic enrichment/homogenization by EKT
2015 (EN)
Φαινοτυπικός και μοριακός χαρακτηρισμός των μικρομεταστατικών κυττάρων ασθενών με καρκίνο του μαστού
Phenotypic and molecular characterization of micrometastatic cells of patients with breast cancer

Παπαδάκη, Μαρία

Αγγελάκη, Σοφία
Κωτσάκης, Αθανάσιος
Γεωργούλιας, Βασίλειος
Θεοδωρόπουλος, Παναγιώτης
Μαυρουδής, Δημήτριος
Κουτσόπουλος, Αναστάσιος
Ποντίκογλου, Χαράλαμπος

Ο καρκίνος του μαστού αποτελεί την πρώτη αιτία νόσησης από καρκίνο στις γυναίκες, ο οποίος αρκετά συχνά διαγιγνώσκεται σε πρώιμα στάδια και αντιμετωπίζεται επιτυχώς [1]. Παρόλα αυτά, σε σημαντικό ποσοστό των ασθενών αναπτύσσονται δευτεροπαθείς μεταστάσεις, οι οποίες αποτελούν την κύρια αιτία θανάτου των ασθενών με καρκίνο [2]. Ο ακριβής μηχανισμός της διαδικασίας ανάπτυξης μεταστάσεων δεν έχει έως σήμερα αποσαφηνιστεί πλήρως, γεγονός που καθιστά επιτακτική την εκτενέστερη μελέτη του. Πληθώρα δεδομένων που προκύπτουν από μελέτες με καρκινικές σειρές και μοντέλα ζώων, καθώς και από ασθενείς με καρκίνο, υποδεικνύουν ότι η δημιουργία μεταστάσεων είναι μία πολυσύνθετη διαδικασία [3]. Τα κύρια στάδια του μεταστατικού μηχανισμού είναι αρχικά ο πολλαπλασιασμός των καρκινικών κυττάρων στην πρωτοπαθή εστία, η διείσδυσή τους στο μεσοκυττάριο χώρο που περιβάλει τον πρωτοπαθή όγκο, η είσοδός τους στη συστηματική κυκλοφορία (ενδαγγείωση), όπου μετακινούνται είτε ως μεμονωμένα κύτταρα, είτε ως συσσωματώματα κυττάρων. Ακολουθεί η μετανάστευσή τους σε απομακρυσμένα σημεία, η έξοδος από την κυκλοφορία (εξαγγείωση) και η διείσδυση σε νέους ιστούς προκειμένου να σχηματίσουν μικρομεταστάσεις. Τέλος, ο ανεξέλεγκτος πολλαπλασιασμός τους στα δευτερεύοντα όργανα που έχουν προσβληθεί οδηγεί στην ανάπτυξη μακροσκοπικά ορατών μεταστάσεων. Οι κυτταρικοί πληθυσμοί που ανιχνεύονται είτε ως διεσπαρμένα καρκινικά κύτταρα (ΔΚΚ) σε δευτεροπαθείς εστίες, είτε ως κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα (ΚΚΚ) στο περιφερικό αίμα των ασθενών, αποτελούν τα μικρομεταστατικά κύτταρα [4;5]. Όπως προκύπτει από πολλές μελέτες έως σήμερα, η ανίχνευση ΚΚΚ στο αίμα των ασθενών με καρκίνο μαστού αποτελεί ανεξάρτητο και ισχυρό δείκτη αυξημένης πιθανότητας υποτροπής και μειωμένης ολικής επιβίωσης, τόσο στην πρώιμη όσο και τη μεταστατική νόσο [6-8]. Επιπλέον, η παρουσία ΚΚΚ σε ασθενείς με καρκίνο μαστού έχει συσχετιστεί με μειωμένη ανταπόκριση στα συνήθη χημειοθεραπευτικά σχήματα [9]. Πέραν όμως της εκτίμησης της παρουσίας των ΚΚΚ, ο μοριακός και φαινοτυπικός χαρακτηρισμός τους αποτελεί κεντρικό θέμα σημαντικής ερευνητικής προσπάθειας από πολλές ομάδες, καθώς δεν διαθέτουν όλα τα ΚΚΚ το ίδιο μεταστατικό δυναμικό [10;11]. Η περαιτέρω μοριακή ανάλυσή τους θα μπορούσε να 10 αναδείξει τα χαρακτηριστικά εκείνα που ευοδώνουν τη μεταστατική διαδικασία, συμβάλλοντας στην καλύτερη κατανόηση του μηχανισμού της μετάστασης [12]. Επιπλέον, η μελέτη των ΚΚΚ παρέχει τη δυνατότητα του προσδιορισμού του μοριακού προφίλ του όγκου ανά πάσα χρονική στιγμή και επομένως θεωρείται ως μια υγρή βιοψία «πραγματικού χρόνου». Η ανίχνευση χαρακτηριστικών που σχετίζονται με επιθετική κλινική συμπεριφορά ή με αντίσταση στη θεραπεία στα ΚΚΚ είναι δυνατόν να ταυτοποιήσει υποομάδες ασθενών με φτωχή πρόγνωση [13]. Οι ασθενείς αυτοί πιθανόν είναι υποψήφιοι για πιο επιθετικές θεραπευτικές προσεγγίσεις ή για θεραπεία με νέους στοχεύοντες παράγοντες, οι οποίοι θα μπορούσαν να επιλεγούν ακόμη και με βάση την έκφραση μορίων-στόχων στα ίδια τα ΚΚΚ [14;15]. Για τους παραπάνω λόγους, τα τελευταία χρόνια αναπτύσσονται ολοένα και περισσότερες τεχνικές για την ανίχνευση και τον περαιτέρω χαρακτηρισμό των ΚΚΚ στο αίμα των ασθενών με καρκίνο [16;17]. Μία σημαντική διαδικασία που λαμβάνει χώρα κατά την ανάπτυξη μεταστάσεων είναι η επιθηλιο-μεσεγχυματική μετάβαση (ΕΜΜ) των καρκινικών κυττάρων, δηλαδή η σταδιακή μετατροπή του επιθηλιακού τους φαινότυπου σε φαινότυπο μεσεγχυματικών κυττάρων [18]. Ο μεσεγχυματικός φαινότυπος που αποκτούν τα καρκινικά κύτταρα διευκολύνει όχι μόνον την αρχική τους διείσδυση μέσω του πρωτοπαθούς όγκου, αλλά και την ενδαγγείωση και μετακίνησή τους μέσω της συστηματικής κυκλοφορίας, καθώς επίσης και την εξαγγείωση και τελικά τη διείσδυσή τους στο νέο όργανο [19]. Παρόλα αυτά, έχει δειχθεί ότι κατά την τελική φάση του αποικισμού των καρκινικών κυττάρων στο νέο ιστό, ο επιθηλιακός τους φαινότυπος επανακτάται μέσω της αντίστροφης διαδικασίας της μεσεγχυματο- επιθηλιακής μετάβασης (ΜΕΜ) [20]. Μία από τις κύριες αλλαγές που παρατηρούνται κατά την ΕΜΜ αφορά στο πρότυπο έκφρασης των ενδιάμεσων ινιδίων του κυτταροσκελετού, όπου παρατηρείται γενικά σημαντική μείωση στην έκφραση της κυτταροκερατίνης, με παράλληλη αύξηση στην έκφραση της βιμεντίνης, η οποία αποτελεί έναν ισχυρό δείκτη ΕΜΜ και εμφανίζεται απαραίτητη για τη διείσδυση και ενδαγγείωση των καρκινικών κυττάρων [21;22]. Επιπλέον, σημαντική αλλαγή παρατηρείται στην έκφραση των μορίων που ενέχονται στις διακυτταρικές επαφές, η οποία έχει βρεθεί ότι επάγεται μέσω μιας σειράς μεταγραφικών παραγόντων, όπως είναι οι TWIST, SNAIL και SLUG. Ο μεταγραφικός παράγοντας TWIST αποτελεί ένα ιδιαίτερα σημαντικό δείκτη ΕΜΜ, ο οποίος ενέχεται σε διάφορα στάδια της 11 μεταστατικής διαδικασίας, όπως η αρχική διείσδυση και η ενδαγγείωση των καρκινικών κυττάρων [23;24]. Επιπλέον, πολυάριθμες μελέτες έχουν δείξει συσχέτιση μεταξύ της παρουσίας χαρακτηριστικών συμβατών με ΕΜΜ στον πρωτοπαθή όγκο των ασθενών με αυξημένη αντίσταση στη χημειοθεραπεία, αυξημένο κίνδυνο υποτροπής και μειωμένη επιβίωση [25-27]. Όπως υποδεικνύεται από πολλές μελέτες τα τελευταία χρόνια, η ΕΜΜ σχετίζεται άμεσα με τη γένεση καρκινικών βλαστικών κυττάρων (ΚΒΚ) [28;29]. Τα ΚΒΚ έχουν ταυτοποιηθεί σε πολλούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του μαστού, ως ένας μικρός υποπληθυσμός κυττάρων με ιδιότητες χαρακτηριστικές των βλαστικών κυττάρων. Σύμφωνα με το μοντέλο των ΚΒΚ, τα κύτταρα αυτά θεωρούνται ως τα μόνα ικανά να «αυτο-ανανεώνονται», να πολλαπλασιάζονται απεριόριστα και να διαφοροποιούνται, επάγοντας το σχηματισμό όλων των κυτταρικών υποπληθυσμών που απαρτίζουν τον πρωτοπαθή όγκο [30;31]. Επιπλέον είναι γνωστό ότι τα ΚΒΚ συμμετέχουν ενεργά στην ανάπτυξη μεταστάσεων, καθώς ευθύνονται για τη διασπορά του πρωτοπαθούς όγκου, δίνοντας γένεση σε όλους τους υποπληθυσμούς του [32;33]. Στον καρκίνο του μαστού, ως ΚΒΚ έχουν ταυτοποιηθεί και απομονωθεί αποτελεσματικά από καρκινικές σειρές και όγκους τα κύτταρα που φέρουν το φαινοτυπικό προφίλ υψηλής έκφρασης CD44 και απούσας ή χαμηλής έκφρασης CD24 (CD44high/CD24-/low) [34;35], καθώς επίσης και εκείνα με υψηλή ενζυμική ενεργότητα της αλδεϋδικής δεϋδρογονάσης (Aldehyde deydrogenase - ALDH) [36;37]. Η πρωτεϊνική έκφραση του ισοένζυμου ALDH1Α1 έχει επίσης χρησιμοποιηθεί εκτεταμένα ως δείκτης ΚΒΚ, ωστόσο αντικρουόμενα εμφανίζονται τα δεδομένα της βιβλιογραφίας σχετικά με την ενεργότητα των 19 συνολικά διαφορετικών ισοένζυμων της ALDH που εκφράζονται σε καρκινικές σειρές και επιθηλιακούς όγκους μαστού [37-39]. Επιπλέον, in vitro και in vivo μελέτες υποστηρίζουν ότι τα ΚΒΚ εμφανίζουν αυξημένη αντίσταση σε ακτινοθεραπεία, χημειοθεραπεία και ορμονοθεραπεία [40], ενώ η παρουσία τους στον πρωτοπαθή όγκο ασθενών με καρκίνο μαστού έχει συσχετιστεί με χειρότερη κλινική έκβαση [36;41]. Σύμφωνα με τα παραπάνω, η ΕΜΜ και η προτεινόμενη θεωρία των ΚΒΚ πιστεύεται ότι κατέχουν σημαντική θέση στην βιολογία των ΚΚΚ. Η παρουσία δεικτών ΚΒΚ ή ΕΜΜ στα ΚΚΚ πιθανόν ταυτοποιεί έναν κυτταρικό υποπληθυσμό με αυξημένη ανθεκτικότητα στη χημειοθεραπεία και ενισχυμένη ικανότητα να 12 δημιουργεί μεταστάσεις. Στα πλαίσια αυτά, το 2010 η ομάδα μας έδειξε ότι τα ΚΚΚ των ασθενών με μεταστατικό καρκίνο μαστού εκφράζουν πράγματι σημαντικούς δείκτες ΚΒΚ, όπως είναι το προφίλ CD44high/CD24-/low και η υψηλή έκφραση της ALDH1, σε επίπεδο μονήρων ΚΚΚ [42]. Επιπλέον, σε μελέτη της ομάδας μας το 2011, διαπιστώθηκε ότι τα ΚΚΚ ασθενών με πρώιμο και μεταστατικό καρκίνο μαστού είναι δυνατόν να βρίσκονται σε μία ενδιάμεση κατάσταση ΕΜΜ, εκφράζοντας παράλληλα επιθηλιακούς και μεσεγχυματικούς δείκτες, όπως είναι η βιμεντίνη και ο μεταγραφικός παράγοντας TWIST. Στη μελέτη αυτή βρέθηκε επιπλέον ότι η συχνότητα των ΚΚΚ με φαινότυπο ενδιάμεσης ΕΜΜ ήταν σημαντικά αυξημένη στο μεταστατικό παρά το πρώιμο στάδιο, υποδεικνύοντας την επιλογή τους κατά τη μεταστατική εξέλιξη της νόσου [43]. Όλο και περισσότερες μελέτες τα τελευταία χρόνια διερευνούν με διάφορες μεθοδολογίες την παρουσία δεικτών για ΕΜΜ και ΚΒΚ στα ΚΚΚ ασθενών με καρκίνο μαστού [44;45], εντούτοις δεν υπάρχουν κλινικές μελέτες που να περιγράφουν το φαινόμενο σε καλά καθορισμένες ομάδες με μεγάλους αριθμούς ασθενών. Επιπλέον, δεν έχει δειχθεί έως σήμερα η σύγχρονη έκφραση δεικτών ΚΒΚ και ΕΜΜ στα ΚΚΚ σε επίπεδο μονήρων κυττάρων. Με βάση τα παραπάνω, σχεδιάστηκε η παρούσα μελέτη για τη διερεύνηση της παρουσίας ΚΚΚ που φέρουν παράλληλα φαινότυπους ΚΒΚ και ενδιάμεσης ΕΜΜ σε ασθενείς με καρκίνο μαστού. Στόχος ήταν η διερεύνηση της συχνότητάς τους σε ασθενείς με πρώιμη και μεταστατική νόσο, η εκτίμηση της πιθανής αντίστασής τους στη χημειοθεραπεία, καθώς επίσης της προγνωστικής τους αξίας. Για το σκοπό αυτό, αναπτύχθηκε μία νέα μεθοδολογία τριπλού ανοσοφθορισμού σε απομονωμένα μονοπύρηνα κύτταρα του περιφερικού αίματος των ασθενών, μέσω της οποίας ελέγχθηκε η έκφραση των κυτταροκερατινών 8, 18 και 19 για τον εντοπισμό των ΚΚΚ, ενώ ως δείκτες ΚΒΚ και ΕΜΜ χρησιμοποιήθηκαν αντίστοιχα η ALDH1 και το TWIST. Η συνέκφραση των παραπάνω μορίων αξιολογήθηκε σε επίπεδο μονήρων κυττάρων μέσω του ημι-αυτοματοποιημένου συστήματος μικροσκοπίας φθορισμού ARIOL. Κατά την ανάπτυξη της μεθόδου, διερευνήθηκαν αρχικά τα διαφορετικά πρότυπα έκφρασης της ALDH1 και του TWIST σε κατάλληλες σειρές ελέγχου και σε τρεις καρκινικές σειρές μαστού, SKBR3, MCF7 και MDA.MB.231, οι οποίες είναι αντιπροσωπευτικές των κύριων μοριακών υπότυπων του καρκίνου του μαστού, HER2-θετικού, ορμονο-θετικού και τριπλά- αρνητικού, αντιστοίχως. Ειδικότερα, η έκφρασης της ALDH1 χαρακτηρίστηκε ως 13 υψηλή (ALDH1high) και χαμηλή ή απούσα (ALDH1low/neg), έπειτα από ποσοτικοποίηση των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης μέσω του συστήματος ARIOL, ενώ η έκφραση του TWIST χαρακτηρίστηκε βάσει της υποκυττάριας εντόπισής του σε πυρηνική (TWISTnuc) και κυτταροπλασματική ή απούσα (TWISTcyt/neg). Σύμφωνα με τα δεδομένα της υπάρχουσας βιβλιογραφίας, ως φαινότυπος ΚΒΚ και ΕΜΜ ορίστηκε η υψηλή έκφραση της ALDH1 και η πυρηνική εντόπιση του TWIST, αντιστοίχως [38;46]. Επιπλέον, μέσω μίας σειράς πειραμάτων ελέγχου με τη χρήση των παραπάνω καρκινικών σειρών, καθώς επίσης και δείγματος φυσιολογικών αιμοδοτών, επιβεβαιώθηκε η υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα της μεθόδου ανίχνευσης των δύο δεικτών στα ΚΚΚ. Ακολούθως, η παραπάνω μεθοδολογία εφαρμόστηκε στα ΚΚΚ 80 ασθενών με πρώιμο και 50 με μεταστατικό καρκίνο μαστού. Όπως διαπιστώθηκε, οι δύο δείκτες ανιχνεύτηκαν στα ΚΚΚ στο σύνολο σχεδόν των ασθενών που μελετήθηκαν, ωστόσο το προφίλ της έκφρασής τους διέφερε μεταξύ των δύο κλινικών σταδίων. Η συχνότητα των ΚΚΚ με φαινότυπο ΚΒΚ (ALDH1high) ήταν σημαντικά αυξημένη στη μεταστατική νόσο, σε αντίθεση με την πρώιμη, όπου ανιχνεύτηκαν κυρίως ΚΚΚ μη- βλαστικού φαινότυπου (ALDH1low/neg). Επιπλέον, η παρουσία των ΚΚΚ με φαινότυπο ενδιάμεσης ΕΜΜ (TWISTnuc) ήταν σημαντικά συχνότερη στο μεταστατικό στάδιο, ενώ αντιθέτως στο πρώιμο ανιχνεύθηκαν συχνότερα ΚΚΚ επιθηλιακού φαινότυπου (TWISTcyt/neg). Αξιολογώντας στη συνέχεια τη συνέκφραση των δύο μορίων σε επίπεδο κυττάρου, διαπιστώθηκε ότι η πλειοψηφία των ασθενών με μεταστατική νόσο είχε ανιχνεύσιμα ΚΚΚ που έφεραν παράλληλα τους δύο φαινότυπους (ALDH1high/TWISTnuc), σε αντίθεση με τους ασθενείς πρώιμου σταδίου, οι οποίοι εμφάνισαν κυρίως ΚΚΚ μη-βλαστικού επιθηλιακού φαινότυπου (ALDH1low/neg/TWISTcyt/neg). Η συσχέτιση μεταξύ των δύο φαινότυπων στα ΚΚΚ των ασθενών με μεταστατικό καρκίνο επιβεβαιώθηκε περαιτέρω και στατιστικά. Η παρούσα μελέτη προσέφερε μία νέα, ευαίσθητη και ειδική μεθοδολογία για το χαρακτηρισμό των ΚΚΚ ως προς τη συνέκφραση δύο πολύ σημαντικών δεικτών ΚΒΚ και ΕΜΜ. Η διαπίστωση ότι σε κάθε εξελικτικό στάδιο του καρκίνου μαστού παρατηρήθηκε διαφορετικό πρότυπο έκφρασης των δύο δεικτών, αφενός αναδεικνύει τη σημασία της φαινοτυπικής ανάλυσης των ΚΚΚ, αφετέρου αντικατοπτρίζει τη δυναμική της εξέλιξης των χαρακτηριστικών ΚΒΚ και ΕΜΜ. Το γεγονός ότι η συχνότητα των ΚΚΚ με σύγχρονη έκφραση των φαινότυπων ΚΒΚ και ενδιάμεσης 14 ΕΜΜ ήταν σημαντικά αυξημένη στη μεταστατική νόσο υποδεικνύει επίσης ότι ο συγκεκριμένος υποπληθυσμός ΚΚΚ επιλέγεται κατά την εξέλιξη της νόσου λόγω της συμμετοχής τους στη μεταστατική διαδικασία. Τέλος, διαπιστώθηκε για πρώτη φορά η συνέκφραση δύο σημαντικών δεικτών ΚΒΚ και ΕΜΜ σε επίπεδο μονήρων ΚΚΚ, ενισχύοντας ακόμη περισσότερο τη συσχέτιση μεταξύ τους, ενώ για πρώτη φορά δείχθηκε ότι οι δύο φαινότυποι μεταβάλλονται παράλληλα στα ΚΚΚ κατά τη μεταστατική εξέλιξη του καρκίνου του μαστού. Στη συνέχεια, διερευνήθηκε η επίδραση της χημειοθεραπείας στη συχνότητα ανίχνευσης των ΚΚΚ με φαινότυπους ΚΒΚ και ενδιάμεσης ΕΜΜ. Για το σκοπό αυτό, η παραπάνω μεθοδολογία εφαρμόσθηκε σε μία μεγαλύτερη και καλά καθορισμένη ομάδα 154 ασθενών με μεταστατικό καρκίνο μαστού πριν την έναρξη της πρώτης γραμμής χημειοθεραπείας. Στους ασθενείς με ανιχνεύσιμα ΚΚΚ πριν τη θεραπεία, ελέγχθηκε επιπλέον δείγμα αμέσως μετά την ολοκλήρωση της θεραπείας. Τα ΚΚΚ που ανιχνεύθηκαν πριν τη θεραπεία στην πλειοψηφία τους έφεραν τους φαινότυπους ΚΒΚ και ενδιάμεσης ΕΜΜ, παρατήρηση η οποία επιβεβαιώθηκε στη συνέχεια και μετά τη θεραπεία. Παρόλο που στην πλειοψηφία των ασθενών η θεραπεία οδήγησε σε μείωση ή πλήρη εξάλειψη των συνολικών ΚΚΚ, εντούτοις είχε επίσης ως αποτέλεσμα τον εμπλουτισμό των ΚΚΚ με χαρακτήρες ΚΒΚ και ενδιάμεσης ΕΜΜ, ενώ ακόμη μεγαλύτερη και στατιστικά σημαντική ήταν η αύξηση των ΚΚΚ που έφεραν παράλληλα τους δύο φαινότυπους. Τα παραπάνω ευρήματα προσφέρουν σημαντικές ενδείξεις ότι τα ΚΚΚ με χαρακτηριστικά ΚΒΚ και ενδιάμεσης ΕΜΜ εμφανίζουν αυξημένη χημειο-αντίσταση, με αποτέλεσμα να επιλέγονται έπειτα από τη χορήγηση χημειοθεραπείας. Η παρούσα μελέτη έδειξε για πρώτη φορά ότι η ανθεκτικότητα των ΚΚΚ στα συνήθη χημειοθεραπευτικά σχήματα ενισχύεται σημαντικά από τη σύγχρονη παρουσία των χαρακτηριστικών ΚΒΚ και ενδιάμεσης ΕΜΜ, αναδεικνύοντας περαιτέρω τη συμμετοχή του συγκεκριμένου υποπληθυσμού ΚΚΚ στη μεταστατική διαδικασία. Τα ευρήματα της παρούσας μελέτης έδειξαν επίσης για πρώτη φορά την προγνωστική σημασία της ανίχνευσης ΚΚΚ μέσω της μικροσκοπίας ARIOL. Ειδικότερα, διαπιστώθηκε ότι ο αριθμός των συνολικών ΚΚΚ, τόσο πριν, όσο και μετά τη χημειοθεραπεία, συσχετίστηκε με πρόοδο νόσου στο τέλος της χημειοθεραπείας, ενώ η παρουσία τους πριν τη χημειοθεραπεία συσχετίστηκε επίσης με συνολική επιβίωση των ασθενών μικρότερη της διετίας. Επιπλέον, η παρουσία 15 ΚΚΚ με χαρακτήρα ΚΒΚ και ενδιάμεσης ΕΜΜ συσχετίστηκε με την παρουσία μεταστάσεων σε συγκεκριμένα όργανα, όπως τα οστά και τους πνεύμονες, ωστόσο, αντικρουόμενα δεδομένα προέκυψαν όσον αφορά στην προγνωστική τους αξία ως προς την ανταπόκριση στη χημειοθεραπεία και την επιβίωση. Παρόλο που η χημειοθεραπεία οδήγησε σε σημαντική αύξηση των ΚΚΚ με χαρακτήρες ΚΒΚ και ενδιάμεσης ΕΜΜ αποκλειστικά στους ασθενείς που έκαναν πρόοδο νόσου και όχι σε εκείνους που ανταποκρίθηκαν στη χημειοθεραπεία, εντούτοις η παρουσία των συγκεκριμένων κυτταρικών υποπληθυσμών συσχετίστηκε με καλύτερη ανταπόκριση στη χημειοθεραπεία και αυξημένη επιβίωση έως την υποτροπή. Η παραπάνω παρατήρηση ενδεχομένως οφείλεται σε στατιστικό λάθος, καθώς στην παρούσα ανάλυση εντάχθηκαν αποκλειστικά οι ασθενείς με ανιχνεύσιμα ΚΚΚ πριν τη χημειοθεραπεία, οι οποίοι πιθανότατα συνιστούν μία ομάδα ασθενών κακής πρόγνωσης. Η αξιολόγηση όλων των ασθενών μετά την ολοκλήρωση της χημειοθεραπείας και η εκτίμηση της κλινικής τους πορείας αναμένεται να συμβάλλουν στην αποσαφήνιση της προγνωστικής σημασίας της ανίχνευσης ΚΚΚ με φαινότυπους ΚΒΚ και ενδιάμεσης ΕΜΜ. Στη συνέχεια, διερευνήθηκε εάν τα ΚΚΚ που εμφανίζουν το φαινότυπο ΚΒΚ όπως ορίστηκε βάσει της υψηλής έκφρασης του ισοένζυμου ALDH1Α1, φέρουν και λειτουργικά χαρακτηριστικά των ΚΒΚ. Ως δείκτης λειτουργικότητας ΚΒΚ χρησιμοποιήθηκε η ενζυμική ενεργότητα της ALDH, ο έλεγχος της οποίας πραγματοποιήθηκε μέσω κατάλληλης μεθοδολογίας, γνωστής ως δοκιμή ALDEFLUOR με τη χρήση κυτταρομετρίας ροής [47]. Η συσχέτιση μεταξύ της ενζυμικής ενεργότητας ALDH και της υψηλής πρωτεϊνικής έκφρασης ALDH1 διερευνήθηκε αρχικά μέσω μίας σειράς πειραμάτων ανοσοφθορισμού, ανοσοαποτύπωσης και δοκιμής ALDEFLUOR στη σειρά ελέγχου HepG και τις τρεις αντιπροσωπευτικές σειρές μαστού SKBR3, MCF7 και MDA.MB.231. Θετική συσχέτιση μεταξύ ενεργότητας και έκφρασης διαπιστώθηκε στα κύτταρα ελέγχου HepG2, σε αντίθεση με τις σειρές μαστού, όπου το ποσοστό των κυττάρων με υψηλή έκφραση ALDH1 ήταν μεγαλύτερο από ότι εκείνων με υψηλή ενεργότητα ALDH, υποδεικνύοντας ότι το ισοένζυμο ALDH1Α1 που εκφράζεται στα καρκινικά κύτταρα μαστού δεν είναι πάντοτε ενζυμικά ενεργό. Τα παραπάνω ευρήματα υποδεικνύουν ότι η μεθοδολογία που αναπτύχθηκε μέσω του συστήματος ARIOL επιτρέπει την ταυτοποίηση του κυτταρικού πληθυσμού που εκφράζει την ενζυμικά ενεργή πρωτεΐνη 16 ALDH1, ωστόσο παράλληλα ανιχνεύει και τα κύτταρα στα οποία η πρωτεΐνη είναι ανενεργή. Tα δεδομένα που προέκυψαν από τα κύτταρα ελέγχου HepG2 επιβεβαιώνουν ότι δεν πραγματοποιείται απώλεια του ενζυμικά ενεργού κυτταρικού πληθυσμού. Εν συνεχεία, διερευνήθηκε η πιθανή συσχέτιση της υψηλής έκφρασης ALDH1 με την ενεργότητα ALDH στα ΚΚΚ ασθενών με μεταστατικό καρκίνο μαστού. Η μέθοδος ανίχνευσης της ενεργότητας ALDH στα ΚΚΚ αναπτύχθηκε μέσω μίας σειράς πειραμάτων σε διαδοχικές αραιώσεις των καρκινικών κυττάρων της κάθε σειράς σε απομονωμένα μονοπύρηνα κύτταρα αίματος φυσιολογικών αιμοδοτών (αραιώσεις των 10, 100, 1.000 και 10.000 κυττάρων ανά 106 αιμοποιητικών κυττάρων). Η ταυτοποίηση των καρκινικών κυττάρων πραγματοποιήθηκε μέσω της ανίχνευσης της έκφρασης των μορίων της επιφάνειας EpCAM και CD45, έναντι της κυτταροκερατίνης, καθώς η δοκιμή ALDEFLUOR δεν επιτρέπει τη σύγχρονη ταυτοποίηση ενδοκυττάριων μορίων. Σε συμφωνία με άλλες μελέτες ανίχνευσης ΚΚΚ μέσω κυτταρομετρίας ροής, η παρούσα μελέτη έδειξε ότι η μέθοδος εμφανίζει υψηλή ευαισθησία, ωστόσο στις μεγάλες αραιώσεις των 10 και 100 καρκινικών κυττάρων παρατηρήθηκε υπερεκτίμηση του αριθμού των καρκινικών κυττάρων. Επιπλέον, η ανίχνευση της ενεργότητας της ALDH πραγματοποιήθηκε με μεγάλη ευαισθησία στο σύνολο των αραιώσεων, ωστόσο και εδώ η παρατηρήθηκε μείωση της ποσοστιαίας ενεργότητας με την αυξανόμενη αραίωση των καρκινικών κυττάρων, υποδεικνύοντας ότι η μεθοδολογία που αναπτύχθηκε ενδείκνυται για ασθενείς με υψηλό φορτίο ΚΚΚ. Ακολούθως, επιλέχθηκε ένα μικρό δείγμα εννέα ασθενών με μεταστατική νόσο και πολλαπλές μεταστάσεις, οι οποίοι είχαν λάβει τουλάχιστον δύο γραμμές χημειοθεραπείας. Στους ασθενείς αυτούς πραγματοποιήθηκε παράλληλα έλεγχος της υψηλής ενεργότητας ALDH και της υψηλής έκφρασης ALDH1 στα ΚΚΚ, μέσω κυτταρομετρίας ροής και της μικροσκοπίας ARIOL, αντίστοιχα. Όπως διαπιστώθηκε, στατιστικά σημαντική ήταν η συσχέτιση τόσο του αριθμού των ΚΚΚ που ανιχνεύτηκαν με τις δύο μεθόδους, όσο και μεταξύ του αριθμού των ΚΚΚ με υψηλή ALDH ενεργότητα και υψηλή ALDH1 έκφραση. Επομένως, η παρούσα μελέτη έδειξε για πρώτη φορά ότι η έκφραση της ALDH1 στα ΚΚΚ των ασθενών με μεταστατικό καρκίνο μαστού σχετίζεται θετικά με την ενεργότητα του ενζύμου, επιβεβαιώνοντας ότι η μεθοδολογία που αναπτύχθηκε μέσω του ARIOL ταυτοποιεί τον πληθυσμό των ΚΚΚ που εμφανίζει δραστικότητα ΚΒΚ. Τέλος, μέσω της κυτταρομετρίας ροής ήταν 17 δυνατή η εκτίμηση της ενεργότητας της ALDH στο σύνολο CD45-αρνητικών κυττάρων ανεξάρτητα από την έκφραση του EpCAM, στα οποία συμπεριλαμβάνεται μεταξύ άλλων ο υποπληθυσμός των ΚΚΚ με πλήρη απώλεια έκφρασης επιθηλιακών δεικτών στα πλαίσια της ολοκληρωμένης ΕΜΜ. Όπως διαπιστώθηκε, η ενεργότητα της ALDH στο συγκεκριμένο πληθυσμό κυττάρων ήταν αυξημένη συγκριτικά με τον πληθυσμό των EpCAM-θετικών/CD45-αρνητικών κυττάρων, υποδεικνύοντας ότι η παραπάνω προσέγγιση επιτρέπει την ανίχνευση του πληθυσμού των ΚΚΚ με πλήρη ΕΜΜ και παράλληλα λειτουργικό χαρακτήρα ΚΒΚ. Συνοψίζοντας, στα πλαίσια της παρούσας διατριβής πραγματοποιήθηκε μία φαινοτυπική ανάλυση των ΚΚΚ ασθενών με καρκίνο μαστού, ως προς την παρουσία χαρακτηριστικών ΚΒΚ και ενδιάμεσης ΕΜΜ. Η παρούσα μελέτη προσέφερε μία νέα μεθοδολογία για την ευαίσθητη και ειδική ανίχνευση της συνέκφρασης δύο σημαντικών δεικτών ΚΒΚ και ΕΜΜ στα ΚΚΚ σε επίπεδο κυττάρου. Όπως διαπιστώθηκε, το προφίλ της έκφρασης των δύο δεικτών στα ΚΚΚ ήταν διαφοροποιημένο μεταξύ της πρώιμης και μεταστατικής νόσου, αναδεικνύοντας τη δυναμική της εξέλιξης των παραπάνω χαρακτηριστικών σε επίπεδο ΚΚΚ. Η διαπίστωση ότι η συχνότητα των ΚΚΚ με χαρακτήρα ΚΒΚ και ενδιάμεσης ΕΜΜ ήταν σαφώς αυξημένη στη μεταστατική νόσο, πρόσφερε σημαντικές ενδείξεις για τη συμμετοχή τους στη μεταστατική διαδικασία. Επίσης περιγράφηκε για πρώτη φορά η σύγχρονη έκφραση δεικτών ΚΒΚ και ΕΜΜ στο ίδιο κύτταρο, επιβεβαιώνοντας τη συσχέτιση μεταξύ των δύο χαρακτηριστικών στα ΚΚΚ. Επιπλέον, βρέθηκε ότι τα ΚΚΚ που έφεραν παράλληλα τους φαινότυπους ΚΒΚ και ενδιάμεσης ΕΜΜ είχαν αυξημένη ανθεκτικότητα στα συνήθη χημειοθεραπευτικά φάρμακα και ότι η έλλειψη ανταπόκρισης στη χημειοθεραπεία συσχετίστηκε με τον εμπλουτισμό του συγκεκριμένου υποπληθυσμού ΚΚΚ. Η παρουσία των παραπάνω πληθυσμών ΚΚΚ συσχετίστηκε επίσης με την παρουσία μεταστάσεων σε συγκεκριμένα όργανα, ενώ η προγνωστική αξία της ανίχνευσής τους ως προς την επιβίωση των ασθενών μένει να διερευνηθεί περαιτέρω. Τέλος, αξιολογήθηκε μέσω κατάλληλης λειτουργικής δοκιμής η δραστικότητα του χαρακτήρα ΚΒΚ των ΚΚΚ ασθενών με μεταστατικό καρκίνο μαστού, επιβεβαιώνοντας ότι η μεθοδολογία που αναπτύχθηκε μέσω του ARIOL ταυτοποιεί έναν ενεργό υποπληθυσμό ΚΚΚ με λειτουργικά χαρακτηριστικά ΚΒΚ. Επομένως, όπως υποδεικνύεται από τα παραπάνω, τα ΚΚΚ με χαρακτηριστικά βλαστικών κυττάρων και ενδιάμεσης ΕΜΜ πιθανά συμμετέχουν στη μεταστατική 18 εξέλιξη του καρκίνου του μαστού και επιπλέον εμφανίζουν αντίσταση στα συνήθη χημειοθεραπευτικά σχήματα. Με την παρούσα μελέτη αναδεικνύεται αφενός η σημασία της εκτενούς φαινοτυπικής μελέτης των ΚΚΚ για την αποσαφήνιση του ρόλου τους στη μεταστατική διαδικασία και αφετέρου η ανάγκη εύρεσης εναλλακτικών θεραπειών που θα στοχεύουν σε μόρια που σχετίζονται άμεσα με τα χαρακτηριστικά ΚΒΚ και ΕΜΜ. Μια τέτοια προσέγγιση θα μπορούσε να συμβάλλει σημαντικά στην αποτελεσματικότερη αντιμετώπιση των ασθενών με καρκίνο μαστού. (EL)
Breast cancer, the most common type of cancer among women, is frequently diagnosed at an early stage and successfully treated. Nevertheless, distant metastases ensue in a significant proportion of patients, thus representing the main cause of death for these patients. Since the exact mechanism of metastases formation has not yet been elucidated, there is a great need for a more extensive study of the metastatic process. Numerous studies in cancer cell lines and animal models have demonstrated the complexity of the metastatic process. The main stages of metastasis development include the proliferation of cancer cells in the primary site, invasion in surrounding tissues and intravasation into the circulation, where they can migrate either as single cells or clusters. Afterwards, cancer cells can extravasaste at distant sites and invade new organs to form micrometastases, where their subsequent proliferation leads to the formation of overt metastases. These cells, identified either as disseminated tumor cells (DTCs) in secondary sites or as circulating tumor cells (CTCs) in the peripheral blood of patients, consist the population of micrometastatic cells. Several studies have shown that the detection of CTCs in peripheral blood of patients with breast cancer is a strong and independent marker for increased risk of relapse and reduced overall survival. Moreover, the presence of CTCs in breast cancer has been strongly correlated with lower response rates to conventional chemotherapies. However, CTCs are a highly heterogeneous population exhibiting differential metastatic potential, therefore their further molecular and phenotypic characterization is of outmost importance. This could highlight those characteristics that prosper metastatic process, contributing to a better understanding of the mechanism of metastasis. Moreover, CTCs are considered as a real time liquid biopsy, which allows the molecular characterization of the tumor at different time points. The identification of CTCs bearing characteristics associated with aggressive behavior or resistance to conventional treatment might also help to identify subgroups of patients with poor prognosis. These patients could be offered more aggressive therapeutic approaches and/or targeted therapies against molecules selected according to their expression on CTCs. Thus, during the last years, a growing number of techniques are being developed for the detection and characterization of CTCs. 20 Epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) of cancer cells is a process holding an important role in metastasis formation, during which the epithelial phenotype dynamically converts to a mesenchymal one. These mesenchymal characteristics enable the initial invasion and intravasation of cancer cells, their migration through the systemic circulation and the subsequent extravasation and invasion at distant sites. Nevertheless, it has been shown that during the colonization of distant organs, they regain an epithelial phenotype through the reverse process of mesenchymal-toepithelial transition (MET). One of the major changes during EMT is related to the expression pattern of the cytoskeleton intermediate filaments. Specifically, a significant reduction of cytokeratin expression along with a simultaneous increase in vimentin expression is usually observed. Moreover, the expression of molecules involved in cell to cell contacts, induced by a series of transcription factors, such as TWIST, SNAIL and SLUG is also modulated. The expression of the putative EMT markers, Vimentin and TWIST is considered essential for the invasion and intravasation of cancer cells in the circulation. In addition, numerous studies have shown that characteristics suggestive of the presence of EMT in primary tumors, are strongly associated with resistance to chemotherapy, high risk of relapse and decreased survival. A growing body of evidence suggests a correlation between the EMT process and the generation of cancer stem cells (CSCs). CSCs have been identified as a small subpopulation in several types of cancers, including breast cancer, and are considered to bear properties of normal stem cells. The CSC model proposes that these cells only, are capable of self-renewal, unlimited proliferation and differentiation, whereas they have also been shown to participate in the metastatic process, giving rise to all the subpopulations that constitute the primary tumor. In breast cancer, CSCs have been effectively identified and isolated from cell lines and tumors on the basis of the CD44high/CD24-/low phenotype or according to the high enzymatic activity of aldehyde dehydrogenase (ALDH). The expression of the ALDH1A1 isoenzyme is also considered as a putative stem cell marker, however, contradictory data appear in the literature concerning the activity of the 19 ALDH isoenzymes found in cell lines and breast tumors. Numerous in vitro and in vivo studies have shown that CSCs are highly resistant to radiotherapy, chemotherapy and hormone therapy, whereas the detection 21 of putative CSCs in primary tumors has been strongly associated with worse clinical outcome. Based on the above, the detection of putative EMT and CSC markers on CTCs could distinguish a subpopulation of CTCs demonstrating chemoresistance and enhanced metastatic potential. In this context, in 2010 our research group showed that CTCs of patients with metastatic breast cancer expressed putative CSC markers, such as CD44high/CD24-/low and ALDH1high. Furthermore, we have recently shown that CTCs of early and metastatic breast cancer patients acquired a partial EMT phenotype, as defined by the co-expression of epithelial and mesenchymal markers, such as Vimentin and TWIST. It was further shown that the frequency of CTCs bearing this partial EMT phenotype was significantly increased in the metastatic setting, suggesting their selection during disease progression. Several studies during the last years have also reported the presence of EMT and CSC characteristics on CTCs by the use of different techniques, however there are no clinical studies including well defined groups with large number of patients. Moreover, the coexpression of CSC and EMT markers at the single CTC level has not yet been reported. On this basis, we investigated whether CTCs of patients with breast cancer, co-express putative stem cell and intermediate EMT phenotypes. Furthermore, we interrogated the frequency of these CTC subpopulations among patients with early and metastatic disease, evaluated their potential prognostic value and assessed the effect of chemotherapy on their distribution. For this purpose, a novel triple immunofluorescence methodology was developed on isolated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of patients, for the detection of cytokeratins 8, 18 and 19 as a CTC marker, along with ALDH1 and TWIST, as putative CSC and EMT markers, respectively. The co-expression of these molecules was evaluated at the single cell level by the use of the semi-automated fluorescence microscopy system ARIOL. For the development of the method, the different expression patterns of ALDH1 and TWIST was initially evaluated in control cell lines and three breast cancer cell lines, SKBR3, MCF7 and MDA.MB.231, representative of the main molecular breast cancer subtypes, HER2-positive, hormone-positive and triple-negative, respectively. Specifically, the expression levels of ALDH1 were characterized as high (ALDH1high) and low or absent (ALDH1low/neg), according to the quantification of the fluorescence levels by the use of the ARIOL system, while the 22 expression of TWIST was defined according to its subcellular localization as nuclear (TWISTnuc) and cytoplasmic or absent (TWISTcyt/neg). According to the current literature, CSC and EMT phenotypes were defined as those bearing high ALDH1 expression levels and nuclear localization of TWIST, respectively. A series of control experiments were also performed in all cell lines above, as well as in normal blood donor samples, to verify that the methodology allows the detection of these markers on CTCs with high sensitivity and specificity. Subsequently, the current methodology was applied to CTCs from 80 patients with early and 50 with metastatic breast cancer. Both markers could be detected on CTCs in almost all patients evaluated, however their expression pattern was different between the two clinical stages. Specifically, CTCs bearing the CSC phenotype (ALDH1high) were more frequently detected in metastatic disease, in contrast to the early disease setting wherein CTCs with a non-stem cell phenotype were mainly detected (ALDH1low/neg). Furthermore, CTCs expressing an intermediate EMT phenotype (TWISTnuc) were more frequent in metastatic disease, whereas in the early stage, CTCs bearing an epithelial phenotype were mainly identified (TWISTcyt/neg). Assessing the co-expression of the two markers at the single cell level, it was shown that the majority of metastatic patients had detectable CTCs co-expressing the two phenotypes (ALDH1high/TWISTnuc), in contrast to the patients with early disease which harboured mainly CTCs expressing a non-stem, epithelial phenotype (ALDH1low/neg /TWISTcyt/neg). The correlation between the two phenotypes on CTCs of metastatic breast cancer patients was further statistically confirmed. This study has provided a new, sensitive and specific method for the characterization of CTCs according to the co-expression of two putative CSC and EMT markers. The finding that the expression pattern of the two markers differed between early and metastatic disease reflects the dynamic evolution of the CSC and EMT states. Furthermore, the finding that the frequency of CTCs co-expressing the two phenotypes was significantly increased in metastatic disease, indicates that this subpopulation might be involved in the metastatic process and that it could be selected during disease progression. Finally, this study showed for the first time that two putative CSC and EMT markers are frequently co-expressed on single CTCs, reinforcing their association, as well as that that the two phenotypes of CTCs changed in parallel during metastatic progression. 23 We next evaluated the effect of chemotherapy on the frequency of CTCs bearing CSC and intermediate EMT characteristics. For this purpose, the current methodology was applied to a larger and well defined group of 154 metastatic breast cancer patients before the initiation of first-line chemotherapy. Patients with detectable CTCs, were also evaluated after the completion of treatment. The majority of CTCs identified, both before and after chemotherapy, were shown to express CSC and partial EMT characteristics. Even though treatment resulted in a significant reduction or elimination of CTCs, cells bearing CSC or partial EMT phenotypes were enriched after treatment. Moreover, a statistically significant increase in CTCs co-expressing the two phenotypes was further confirmed. These findings provide important evidence that CTCs with CSC and intermediate EMT features exhibit chemo-resistance and therefore are selected after chemotherapy administration. The current study showed for the first time that the resistance of CTCs to conventional chemotherapy regiments is enhanced by the simultaneous presence of CSC and intermediate EMT characteristics, further supporting the participation of this CTC subpopulation in the metastatic process. The current study also showed for the first time the prognostic value of CTCs detected by the ARIOL system. Specifically, the total CTC number both before and after chemotherapy was correlated with disease progression at the end of chemotherapy, while CTC detection prior to chemotherapy was further associated with lower rates of 2-year survival. Moreover, the presence of CTCs bearing CSC and EMT phenotypes was also correlated to metastases in specific organs such as bones and lung, however, contradictory data emerged regarding their prognostic value in terms of response to treatment and survival. Even though chemotherapy led to a significant increase of CTCs expressing CSC and partial EMT phenotypes exclusively among patients who progressed at the end of treatment, the detection of these subpopulations was associated with better response to chemotherapy and increased progression-free survival. We further investigated whether CTCs bearing the stem cell phenotype, as defined by the high expression of the isoenzyme ALDH1A1, also acquire functional stem cell characteristics. The enzymatic activity of ALDH was used as a functional marker of CSCs, which was evaluated by ALDEFLUOR assay and the use of flow cytometry. First, the correlation between ALDH enzymatic activity and high ALDH1 24 protein expression was interrogated via a series of immunofluorescence experiments, immunoblotting and ALDEFLUOR in HepG control cells and three breast cancer cell lines, SKBR3, MCF7 and MDA.MB.231. A positive correlation between activity and expression was shown in HepG2 cells, confirming that the methodology developed by ARIOL allows the identification of the functional cell population. However, the percentage of cells expressing high ALDH1 levels was higher than the percentage of those bearing high ALDH activity in all breast cancer cell lines evaluated. These findings indicate that the ALDH1A1 isoenzyme which is expressed in breast cancer cells is not always enzymatically active. Therefore, it is suggested that the methodology developed by ARIOL system allows the identification of cell populations that express an enzymatically active ALDH1 protein, however cells that express an inactive protein are also being detected. Subsequently, we investigated the correlation between high ALDH1 expression and ALDH activity in CTCs from metastatic breast cancer patients. Τhe methodology for the detection of ALDH activity on CTCs was developed through a series of experiments using serial dilutions of tumor cells from each cell line into isolated PBMCs from normal blood donors (dilutions of 10, 100, 1.000 and 10.000 cells per 106 PBMCs). Tumor cells were detected by the expression of EpCAM and CD45 surface molecules instead of cytokeratin, since the evaluation of intracellular proteins cannot be combined with the ALDEFLUOR assay. CTCs could be identified in all the above dilutions, however an overestimation of cell counts was observed in low concentrations of 10 and 100 tumor cells per 106 PBMCs. ALDH activity could also be detected in all dilutions, however the recovery rate was reduced in low cell concentrations, suggesting that the developed methodology is appropriate for patients bearing high CTC counts only. Subsequently, the enzymatic activity and expression of ALDH was investigated by the use of flow cytometry and the ARIOL system, respectively, on CTCs from nine breast cancer patients, who had multiple metastases and had received at least two lines of treatment. A statistically significant correlation was confirmed regarding the CTC counts detected by the two methods, as well as between the number of CTCs bearing high ALDH activity and high ALDH1 expression. This study showed for the first time that the expression of ALDH1 on CTCs of metastatic breast cancer patients was correlated to ALDH enzymatic activity, further confirming that the methodology developed by the ARIOL system allows the identification of a CTC population with 25 CSC activity. Finally, ALDH enzymatic activity was evaluated on CD45-negative cells, which include the subpopulation of CTCs that have completely lost the expression of epithelial markers in the context of full EMT. It was shown that ALDH activity in these cells was increased, compared to the population of EpCAMpositive/ CD45-negative cells, suggesting that the current approach allows the detection of CTCs bearing a fully EMT phenotype and also functional characteristics of CSCs. To summarize, in the context of the present thesis, we performed a phenotypic analysis of CTCs from breast cancer patients, regarding the presence of stem cell and partial EMT characteristics. The present study provides a new methodology that allows the sensitive and specific detection of CSC and EMT markers and their coexpression at the single CTC level. The expression pattern of both markers was differentiated between the early and metastatic disease stage, highlighting the dynamic evolution of these characteristics on CTCs. The observation that the frequency of CTCs bearing a stem cell and partial EMT phenotype was significantly higher in metastatic disease, provides evidence for their involvement in the metastatic process. It was also described for the first time that CSC and EMT markers are frequently co-expressed on the same CTC, further confirming the correlation between the two states in CTCs. Furthermore, it was found that CTCs co-expressing these phenotypes were highly resistant to conventional chemotherapy and that the enrichment of this CTC subpopulation was associated with disease progression at the end of treatment. The detection of CTCs bearing these phenotypes was also associated with metastases in specific organs, while their prognostic value for patients' survival remains to be further investigated. Finally, the simultaneous evaluation of the functional stem cell activity of CTCs in a subset of metastatic breast cancer patients further confirmed that the methodology developed by the ARIOL, identified an active CTC subpopulation with CSC characteristics. To conclude, CTCs acquiring CSC and partial EMT characteristics consist an aggressive CTC population, which might be involved in the metastatic progression of breast cancer and exhibit increased chemoresistance. The present study highlights the significance of the extensive phenotypic analysis of CTCs for the determination of their role in the metastatic process, as well as the need for alternative targeted therapies against molecules associated with stem 26 cell and EMT features. This approach could contribute to a more effective management of breast cancer patients. (EN)

text

Κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα
Καρκίνος μαστού
Breast cancer
Circulating tumor cells

Πανεπιστήμιο Κρήτης (EL)
University of Crete (EN)

2015-03-31




*Institutions are responsible for keeping their URLs functional (digital file, item page in repository site)