Επιδημιολογικές και κλινικές μελέτες έχουν καταδείξει μια αντιστρόφως
ανάλογη συσχέτιση μεταξύ των επίπεδων της HDL χοληστερόλης και του
κινδύνου εμφάνισης στεφανιαίας νόσου στον άνθρωπο. Κύριο πρωτεϊνικό
συστατικό των λιποπρωτεϊνών υψηλής πυκνότητας (HDL) αποτελεί η
απολιποπρωτεΐνη Α-Ι (αποΑ-Ι), η οποία και κατέχει σημαντικό ρόλο στη
βιογένεση, τη δομή, καθώς και τις λειτουργίες της HDL. Η αποΑ-Ι
αλληλεπιδρά με πλήθος υποδοχέων και ενζύμων (ABCA1, ABCG1, SR-BI,
LCAT) που συμμετέχουν ενεργά στην βιογένεση, τον καταβολισμό και τις
λειτουργίες της HDL. Αποτέλεσμα αυτών των αλληλεπιδράσεων είναι η
ενεργοποίηση μηχανισμών, όπως η εκροή χοηστερόλης, η διατήρηση της
ακεραιότητας του ενδοθηλίου καθώς και αντι-οξειδωτικοί, αντι-φλεγμονώδεις
και αντι-αποπτωτικοί μηχανισμοί, οι οποίοι συμβάλλουν στην προστασία από
την αθηρωμάτωση. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η
μελέτη του ρόλου της αποΑ-Ι στις αντιφλεγμονώδεις και τις
αθηροπροστατευτικές δράσεις της HDL in vivo.
H ρευματοειδής αρθρίτιδα (ΡΑ) είναι μια χρόνια αυτοάνοση νόσος με
αυξημένη θνητότητα, η οποία οφείλεται μερικώς σε καρδιαγγειακά αίτια.
Επιπλέον, τα χαμηλά επίπεδα HDL χοληστερόλης αποτελούν δείκτη για
διάφορες φλεγμονώδεις νόσους, ενώ τα επίπεδα προφλεγμονώδους HDL
βρίσκονται αυξημένα σε ασθενείς με ΡΑ.
Στόχος της πρώτης ενότητας της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη του
ρόλου της HDL στη ρευματοειδή αρθρίτιδα. Για το σκοπό αυτό εφαρμόσθηκε
ένα μοντέλο της ασθένειας σε αγρίου τύπου ποντικούς και ποντικούς με
έλλειψη σε αποΑ-Ι (apoA-I-/-) και μελετήθηκε σε αυτό η επίδραση της έλλειψης
της HDL στην παθογένεση της ΡΑ, η επίδραση της χρόνιας φλεγμονής στα
επίπεδα και τις αθηροπροστατευτικές δράσεις της HDL, καθώς και κατά πόσο
η HDL μπορεί να δράσει στο ανοσοποιητικό σύστημα οδηγώντας σε μείωση
της φλεγμονής. Έπειτα από την επαγωγή της αρθρίτιδας οι ποντικοί αγρίου
τύπου εμφάνισαν κατά κύριο λόγο μέτρια έως σοβαρή φλεγμονή, ενώ η
πλειοψηφία των apoA-I-/- ποντικών εμφάνισαν το βαρύτερο φαινότυπο που
χαρακτηρίζεται από το σχηματισμό πάννου. Προκειμένου να μελετηθεί η
επίδραση της HDL στις Τh1 και Th17 ανοσοαπόκρισεις, οι οποίες εμπλέκονται
vi
στην ανάπτυξη της ΡΑ, πραγματοποιήθηκε ανοσοποίηση αγρίου τύπου
ποντικών με οβαλβουμίνη και προσδιορίστηκε ο αντιγονο-ειδικός
πολλαπλασιασμός και η διαφοροποίηση των Τh λεμφοκυττάρων παρουσία
αυξανόμενων συγκεντρώσεων συνθετικής HDL (rHDL). Η επαγωγή και ο
πολλαπλασιασμός των αυτοδραστικών Τ λεμφοκυττάρων προσδιορίστηκε με
βάση τα εκκρινόμενα επίπεδα κυτταροκινών (IFN-γ, IL-17, IL-2) στα θρεπτικά
μέσα των καλλιεργειών. Τα αποτελέσματα αυτών των πειραμάτων κατέδειξαν
μια δοσο-εξαρτώμενη αναστολή στη σύνθεση των κυτταροκινών σαν
αποτέλεσμα της χορήγησης αυξανόμενων συγκεντρώσεων rHDL στα
κύτταρα. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η επίδραση της rΗDL σε καλλιέργεια
δενδριτικών κυττάρων, στα οποία η επώαση με rHDL οδήγησε σε μείωση της
έκκρισης προ-φλεγμονωδών κυτταροκινών (IL-6, IL-12, IL-23, IL-8, TNF-α) και
της έκφρασης συν-διεγερτικών μορίων (CD40, CD80, CD86, MHC-II). Τέλος,
μελετήθηκε η επίδραση της rΗDL σε καλλιέργεια δενδριτικών κυττάρων με
έλλειψη σε καθέναν από τους υποδοχείς της HDL (ABCG1, ABCA1, SR-BI).
Στην περίπτωση των δενδριτκών κυττάρων με έλλειψη στον ABCA1 ή τον
SR-BI, η rHDL δε μπόρεσε να καταστείλλει την ενεργοποίηση τους
καταδεικνύοντας τη συμμετοχή των δύο αυτών υποδοχέων στον μηχανισμό
δράσης της.
Το δεύτερο μέρος της παρούσας διατριβής αφορά στη μελέτη της
επίδρασης δύο φυσικά απαντώμενων μεταλλάξεων της αποΑ-Ι, των
αποA-I(L141R)Pisa και αποA-I(L159R)FIN στη βιογένεση της HDL και την
ανάπττυξη αθηροσκλήρωσης in vivo. Ετεροζυγώτες για οποιαδήποτε από τις
δύο παραπάνω μεταλλάξεις παρουσιάζουν πολύ χαμηλά επίπεδα HDL
χοληστερόλης στο πλάσμα και ορισμένοι από αυτούς εμφανίζουν πρόωρη
αθηροσκλήρωση.
Για τη μελέτη των ιδιοτήτων των συγκεκριμένων μεταλλάξεων in vivo
δημιούργηθηκαν διαγονιδιακοί ποντικοί οι οποίοι εκφράζουν την ανθρώπινη
αποΑ-Ι στο ήπαρ. Για το σκοπό αυτό, η αγρίου τύπου (WT) και τα παραπάνω
μεταλλάγματα της ανθρώπινης αποΑ-Ι κλωνοποιήθηκαν σε κατάλληλο φορέα
καθοδικά του υποκινητή του γονιδίου της τρανσθυρετίνης (TTR1). Από την
ανάλυση αυτή προέκυψαν τα ζώα «ιδρυτές», τα οποία διασταυρώθηκαν με
apoA-I-/- ποντικούς για τη δημιουργία διαγονιδιακών ποντικών που
εκφράζουν μόνο την αντίστοιχη, είτε αγρίου τύπου είτε μεταλλαγμένη,
vii
ανθρώπινη αποΑ-Ι. Τα ζώα που προέκυψαν χαρακτηρίστηκαν ως προς το
λιπιδικό και λιποπρωτεϊνικό τους προφίλ, τη δομή και τη λειτουργικότητα της
HDL και την ανάπτυξη αθηροσκλήρωσης. Οι διαγονιδιακοί ποντικοί που
εξέφραζαν οποιοδήποτε εκ των δύο μεταλλαγμάτων της αποΑ-Ι εμφάνισαν
πολύ χαμηλά επίπεδα ολικής και HDL χοληστερόλης, καθώς και αποΑ-Ι στον
ορό. Επιπλέον, στον ορό αυτών των ποντικών ανιχνεύθηκαν λίγα μικρού
μεγέθους HDL σωματίδια με preβ2 και α3, α4 ηλεκτροφοριτική κινητικότητα.
Επιπλέον, τα HDL σωματιδία που έφεραν τις μεταλλαγμένες μορφές της
αποΑ-Ι εμφάνισαν μειωμένες αντι-οξειδωτικές ιδιότητες αλλά αυξημένη
ικανότητα ABCA1-εξαρτώμενης εκροής χοληστερόλης από τα μακροφάγα,
καθώς και αυξημένη ικανότητα να προωθούν τη μετανάστευση των
ενδοθηλιακών κυττάρων. Τέλος, έπειτα από 14 εβδομάδες σε δίαιτα υψηλής
περιεκτικότητας σε λίπη, η ανάπτυξη αθηρωματικών πλακών στην αορτή ήταν
σημαντικά υψηλότερη στους διαγονιδιακούς ποντικούς που εξέφραζαν τις
μεταλλαγμένες μορφές της αποΑ-Ι σε σχέση με αυτούς που είτε εξέφραζαν
την αγρίου τύπου αποΑ-Ι είτε εμφάνιζαν παντελή έλλειψη της αποΑ-Ι (apoA-I-/-
).
Πρόσφατες έρευνες υποστηρίζουν πως η φυσιολογικά
αθηροπροστατευτική HDL μπορεί να μετατραπεί σε αθηροματωγόνο ως
αποτέλεσμα των οξειδωτικών τροποποιήσεων που υφίσταται η αποΑ-Ι από το
ένζυμο μυελοπεροξειδάση (MPO). Συγκεκριμένα, έχει προταθεί πως ο
συνδυασμός χλωρίωσης της τυροσίνης-192 και οξείδωσης της μεθειονίνης-
148 μειώνει την ικανότητα της αποΑ-Ι να επάγει έξοδο χοληστερόλης μέσω
του μεταφορέα ABCA1. Επιπλέον, in vitro πειράματα έχουν δείξει πως η
οξείδωση της μεθειονίνης-148 από την MPO οδηγεί σε απώλεια της
ικανότητας της αποΑ-Ι να ενεργοποιήσει το ένζυμο LCAT. Τα αίτια, καθώς και
οι μηχανισμοί δημιουργίας δυσλειτουργικών μορίων HDL παραμένουν
αδιευκρίνιστα.
Στόχος του τρίτου μέρους της διατριβής ήταν η μελέτη των μηχανισμών
με τους οποίους η μυελοπεροξειδάση επιδρά στην αποΑ-Ι και παράγει
δυσλειτουργικά HDL σωματίδια in vivo. Για το σκοπό αυτό δημιουργήθηκαν
ανασυνδυασμένοι αδενοϊοί που εκφράζουν την αγρίου τύπου αποΑ-Ι (apoA-I
WT), τις μεταλλαγμένες μορφές apoΑ-Ι(Met148Ala) και apoΑ-Ι(Tyr192Ala),
καθώς και την ανθρώπινη μυελοπεροξειδάση. Αρχικά, χρησιμοποιήθηκε η
viii
μέθοδος κατευθυνόμενης μεταλλαξιγένεσης για τη δημιουργία των παραπάνω
μεταλλάξεων στο γονίδιο της ανθρώπινης αποΑ-Ι. Παράλληλα, ουδετερόφιλα
κύτταρα απομονώθηκαν από ανθρώπινο ολικό αίμα και το RNA που
απομονώθηκε από αυτά χρησιμοπoιήθηκε για την κλωνοποίηση του cDNA
της MPO. Οι αλληλουχίες που προέκυψαν κλωνοποιήθηκαν στο φορέα
pAdTrack-CMV και οι αντίστοιχοι ανασυνδυασμένοι αδενοϊοί παρήχθησαν σε
μεγάλη κλίμακα με τη μέθοδο AdEasy, απομονώθηκαν με υπερφυγοκέντρηση
σε διαβάθμιση χλωριούχου καισίου και τιτλοδοτήθηκαν με τη δοκιμασία
σχηματισμού μολυσματικών πλακών. Οι τιτλοδοτημένοι αδενοϊοί ελέγχθηκαν
ως προς τη μολυσματικότητά τους και την παραγωγή της αντίστοιχης
πρωτεΐνης. Οι παραπάνω αδενοϊοί που εκφράζουν τις διάφορες μορφές
αποΑ-Ι μπορούν μελλοντικά να χρησιμοποιηθούν είτε μεμονωμένα είτε σε
συνδυασμό με τον αδενοϊό που εκφράζει MPO για την επιμόλυνση apoA-I-/-
ποντικών. Με τον τρόπο αυτό θα μπορέσει να προσδιοριστεί in vivo η
επίδραση του ενζύμου αυτού στα επίπεδα των λιπιδίων του πλάσματος, το
σχήμα, το μέγεθος και τη λειτουργικότητα της HDL.
Πρόσφατες γονιδιωματικές μελέτες μεγάλης κλίμακας έχουν αναδείξει
νέους γενετικούς τόπους, μεταξύ των οποίων το γονίδιο GALNT2 (GalNAc
Transferase 2), που σχετίζονται με χαμηλά επίπεδα HDL. Η GALNT2 είναι
ένα ένζυμο που συμμετέχει στην O-γλυκοζυλίωση και καταλύει τη μεταφορά
σακχάρων σε κατάλοιπα σερίνης ή θρεονίνης πρωτεϊνών. Δεδομένου ότι η O-
γλυκοζυλίωση κατέχει ρυθμιστικό ρόλο για πληθώρα πρωτεϊνών, είναι πιθανό
η GALNT2 να επηρεάζει τις συγκεντρώσεις των λιπιδίων τροποποιώντας
διάφορες πρωτεΐνες που συμμετέχουν στο μεταβολισμό της HDL.
Η τελευταία ενότητα αφορά τη μελέτη του ρόλου της GALNT2 στο
μεταβολισμό της HDL in vivo με χρήση της γονιδιακής μεταφοράς μέσω
αδενοϊών σε apoA-I διαγονιδιακούς ποντικούς. Για το σκοπό αυτό αρχικά
απομονώθηκε από κύτταρα HepG2 το cDNA της ανθρώπινης GALNT2 το
οποίο κλωνοποιήθηκε σε κατάλληλο φορέα, και στη συνέχεια
χρησιμοποιήθηκε για την παραγωγή του αδενοϊού Ad-GALNT2 σύμφωνα με
το πρωτόκολλο AdEasy. Ο αδενοϊός παρήχθη σε μεγάλη κλίμακα,
απομονώθηκε και τιτλοδοτήθηκε όπως αναφέρθηκε παραπάνω. Ο
τιτλοδοτημένος αδενοϊός πρόκειται μελλοντικά να χορηγηθεί σε ποντικούς
από τους οποίους έχει απαλειφεί το γονίδιο της αποΑ-Ι, ενώ ταυτόχρονα
ix
φέρουν το ανθρώπινο γονίδιο της αποΑ-Ι υπό τον έλεγχο του φυσικού
υποκινητή και ενισχυτή του. Στους μολυσμένους ποντικούς θα
πραγματοποιηθεί μια σειρά αναλύσεων προκειμένου να προσδιοριστούν τα
επίπεδα λιπιδίων στο πλάσμα, η δραστικότητα συγκεκριμένων ενζύμων (LPL,
LCAT), καθώς και η δομή και η λειτουργικότητα των HDL σωματιδίων που θα
προκύψουν. Με τον τρόπο αυτό θα μπορέσει να εκτιμηθεί η επίδραση της
GALNT2 τόσο στη δομή όσο και το μεταβολισμό της HDL in vivo.
(EL)
Numerous epidemiological and clinical studies have demonstrated an
inverse correlation between plasma high-density lipoprotein (HDL) cholesterol
levels and the risk for coronary heart disease in humans. Apolipoprotein A-I
(apoA-I) constitutes the major protein component of HDL and possesses a
central role in HDL biogenesis, structure and function. ApoA-I interacts with
several receptors and enzymes (ABCA1, ABCG1, SR-BI, LCAT) that
participate in HDL metabolism and functions. The above interactions lead to
the activation of atheroprotective mechanisms such as cholesterol efflux,
maintenance of endothelial integrity as well as mechanisms involving antioxidative,
anti-inflammatory and anti-apoptotic actions. The aim of this PhD
thesis was to study the role of apoA-I in the anti-inflammatory and
atheroprotective functions of HDL in vivo.
Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic inflammatory autoimmune disease
that is associated with increased cardiovascular morbidity and mortality. In
addition, low HDL cholesterol levels are considered a marker for various
chronic inflammatory conditions, while the levels of pro-inflammatory HDL are
increased in RA patients.
In Chapter I we studied the role of HDL in RA. For this purpose, we used
a model of antigen-induced arthritis in wild-type and in apoA-I-/- mice to
investigate the effect of HDL deficiency on the pathogenesis of RA as well as
the effect of chronic inflammation on HDL levels and atheroprotective
functions. Moreover, we assessed HDL’s ability to modulate the immune
system and attenuate the inflammatory response. Following induction of
arthritis, wild-type mice demonstrated moderate to severe inflammation while
the majority of apoA-I-/- mice exhibited a more severe phenotype which was
associated with pannus formation. In order to study the effect of HDL on Τh1
and Th17 immune responses which are implicated in RA development, the
antigen-specific proliferation and differentiation of Th cells in the presence of
increasing amounts of reconstituted HDL was determined in draining lymph
nodes (dLNs) from ovalbumin-immunized wild-type mice. The induction and
proliferation of autoreactive Τ cells was determined by measuring cytokine
levels (IFN-γ, IL-17, IL-2) in culture medium. According to these results
ii
treatment of dLN cells with rHDL led to a dose-dependent suppression of
cytokine secretion. Next, we studied the effect of rΗDL treatment on bonemarrow-
derived dendritic cells (BMDCs) and concluded that rHDL suppressed
pro-inflammatory cytokine secretion (IL-6, IL-12, IL-23, IL-8, TNF-α) and
downregulated co-stimulatory molecules (CD40, CD80, CD86, MHC-II) in
these cells. Finally, we showed that the suppressive effect of rHDL was
attenuated in BMDCs lacking either ABCA1 or SR-BI, thus providing evidence
for an important role of these two membrane lipid transporters in the HDLmediated
anti-inflammatory functions on DCs.
In Chapter II we investigated the effect of two naturally occurring
mutations of human apoA-I, apoA-I(L141R)Pisa and apoA-I(L159R)FIN, on HDL
biogenesis and atherosclerosis development in vivo. Humans that are
heterozygotes for either of these apoA-I mutations exhibit very low levels of
plasma HDL cholesterol and some of them develop premature
atherosclerosis.
In order to study the properties of the above mutations in vivo we
generated transgenic mice that express either wild-type or mutant human
apoA-I in the liver. Briefly, wild-type and mutant forms of apoA-I were cloned
downstream of the mouse transthyretin promoter (TTR1). The TTR1-apoA-I
fragments were excised and used to inject male pronucleus of C57BL6/CBA
F2 fertilized eggs for transgenesis purposes. Selected founder animals were
crossed with apoA-I-/- mice to obtain human apoA-I transgenic mice on an
apoA-I deficient background. The human apoA-I transgenic mice were
analyzed for abnormalities in their lipid and lipoprotein profile, in HDL
structure and functionality as well as for predisposition to atherosclerosis.
Transgenic mice expressing either mutant apoA-I form were characterized by
very low serum total and HDL-cholesterol, as well as serum apoA-I levels.
Moreover, these mice generated only few small spherical HDL particles with
pre-β2 and α3, α4 electrophoretic mobility. HDL particles containing either
apoA-I mutant exhibited attenuated anti-oxidative properties but increased
capacity to promote ABCA1-dependent cholesterol efflux and endothelial cell
migration. Finally, the expression of human apoA-I(L141R)Pisa or apoAI(
L159R)FIN in mice was associated with increased diet-induced
iii
atherosclerosis compared to mice expressing wild-type apoA-I and apoA-I
deficient mice.
Recent studies suggest that the normally atheroprotective HDL can be
rendered atherogenic as a result of the myeloperoxidase (MPO)-mediated
oxidative modifications in apoA-I. It has been shown that MPO-dependent
chlorination of Tyr-192 combined with oxidation of Met-148 residues of apoA-I
inhibit its ability to promote ABCA1-mediated cholesterol efflux. Moreover, in
vitro studies have demonstrated that oxidation of Met-148 by MPO impairs the
ability of apoA-I to activate LCAT. However, the mechanisms underlying
formation of dysfunctional HDL particles remain largely unknown.
In Chapter III we aimed at investigating the mechanisms of apoA-I
modification by MPO leading to the generation of dysfunctional HDL in vivo.
For this purpose, we generated recombinant adenoviruses carrying either
wild-type (apoA-I WT) or mutant forms of apoA-I [apoΑ-Ι(Met148Ala) και
apoΑ-Ι(Tyr192Ala)] as well as adenovirus expressing human MPO. The above
mutations in the human apoA-I gene were generated by site-directed
mutagenesis, while the human MPO cDNA sequence was cloned from
neutrophils isolated from human peripheral blood. All sequences were
subcloned into the pAdTrack-CMV vector and recombinant adenoviruses
were generated according to the AdEasy protocol, purified by CsCl gradient
ultracentrifugation and titrated by performing the plaque assay. The titrated
adenoviruses were used to infect cells to determine efficient production and
secretion of the corresponding protein. The adenoviruses expressing the
above apoA-I mutants will be used either separately or in combination with the
adenovirus expressing MPO to infect apoA-I-/- mice, and allow the
investigation of the in vivo effect of MPO on lipids concentration, HDL
structure and functions.
Genome-wide association studies have identified new genetic loci,
including the GALNT2 (GalNAc Transferase 2) gene, that are associated with
low HDL levels. GALNT2 is an enzyme that participates in O-glycosylation of
proteins by catalyzing the transfer an N-acetyl galactosamine to
serine/threonine residues. Since O-glycosylation possesses a regulatory role
in protein function, it is possible that GALNT2 affects lipid concentration by
modifying several of the proteins that participate in the HDL pathway.
iv
In Chapter IV we aimed at investigating the role of GALNT2 in HDL
metabolism in vivo by performing adenovirus-mediated gene transfer in apoAI
transgenic mice. To this end, the sequence of human GALNT2 cDNA was
cloned from HepG2 cells and then subcloned into an appropriate vector which
was used to generate a recombinant adenovirus expressing GALNT2 (Ad-
GALNT2) according to the AdEasy methodology. The generated adenovirus
was subsequently amplified, purified and titrated as aforementioned.
Adenovirus-mediated gene transfer will be performed in transgenic mice that
express the human apoA-I gene under the control of its proximal promoter
and enhancer in an apoA-I deficient background. Following infection, a series
of analyses will be performed in order to determine serum lipids
concentration, enzyme activities (LPL, LCAT) as well as HDL structure and
functionality. The above experiments will provide insights on the effect of
GALNT2 on HDL structure and metabolism in vivo
(EN)
