Ο Διφωτονικά Διεγειρόμενος Φθορισμός η Παραγωγή Δεύτερης και Τρίτης Αρμονικής είναι νέα σχετικώς εργαλεία για την απεικόνιση σε μικροσκοπικό επίπεδο βιολογικών δομών και διαδικασιών. Ο συνδυασμός τους σε ένα κοινό απεικονιστικό σύστημα είναι δυνατόν να προσφέρει μοναδικές και το σπουδαιότερο, συμπληρωματικές πληροφορίες σχετικά με τη δομή τη μορφολογία και τη λειτουργία ιστών, αλλά και μεμονωμένων κυττάρων. Στα πλαίσια της παρούσας εργασίας αναπτύχθηκε μία εύχρηστη, αξιόπιστη, συμπαγής πειραματική διάταξη για την ταυτόχρονη in vivo απεικόνιση βιολογικών δειγμάτων, με χρήση των μη γραμμικών φαινόμενων του Διφωτονικά Διεγειρόμενου Φθορισμού και της Παραγωγής Δεύτερης και Τρίτης Αρμονικής. Χρησιμοποιώντας αυτήν τη διάταξη, εξήχθησαν πολύτιμες πληροφορίες σχετικά με τη δομή και τη λειτουργία των ιστών και των κυττάρων του νηματοειδούς C. elegans.
Μέσω της πειραματικής διάταξης που αναπτύξαμε, έγινε δυνατή η απεικόνιση του μπροστινού και του οπίσθιου μέρους του C. elegans με μεγάλη διακριτική ικανότητα (~200nm). Χρησιμοποιήθηκε ένας μεγάλος αριθμός βιολογικών δειγμάτων. Wild type, γενετικά μεταλλαγμένα που εκφράζουν Green Fluorescent Protein (GFP) (είτε στη μεμβράνη, ή στο κυτταρόπλασμα) στους νεύρώνες, γενετικά μεταλλαγμένα που εκφράζουν GFP στο κυτταρόπλασμα του φάρυγγα και DsRed στο κεφάλι και στους νευρώνες. Επιπλέον, καθορίστηκαν οι βέλτιστες πειραματικές συνθήκες για την in vivo ανίχνευση σήματος Παραγωγής Τρίτης Αρμονικής από το C. elegans, το οποίο δίνει πολύτιμες πληροφορίες για τα ανατομικά και μορφολογικά χαρακτηριστικά και τις εσωτερικές δομές του νηματοειδούς. Αξίζει να σημειωθεί ότι είναι η πρώτη φορά που επιτεύχθηκε η καταγραφή σήματος Παραγωγής Τρίτης Αρμονικής από το C. elegans.
Με τη βοήθεια των μετρήσεων Παραγωγής Τρίτης Αρμονικής, έγινε εφικτή η απεικόνιση εκφυλισμένων νευρώνων. Μέσω αυτών των μετρήσεων πραγματοποιήθηκε ο ακριβής in vivo προσδιορισμός του σχήματος και των δομικών χαρακτηριστικών των εκφυλισμένων νευρώνων στο οπίσθιο μέρος του νηματοειδούς καθώς και η απεικόνιση της εξέλιξης των εκφυλισμένων νευρώνων σε πραγματικό χρόνο.
Η ανάπτυξη της απεικονιστικής πειραματικής διάταξης για την in vivo καταγραφή τριών διαφορετικών μη γραμμικών σημάτων από βιολογικά δείγματα αποδεικνύεται ιδιαίτερα χρήσιμη για μια σειρά εφαρμογών στο πεδίο της βιολογίας και της ιατρικής. Προσφέρει νέες προοπτικές στην έρευνα εμβρυικών μορφολογικών αλλαγών καθώς και πολύπλοκων αναπτυξιακών διαδικασιών. Η τρισδιάστατη ανάλυση, επιτρέπει τη σύλληψη οπτικών πληροφοριών σχετικά με τις αναπτυξιακές διαδικασίες σε κυτταρικό ή υποκυτταρικό επίπεδο που συμβαίνουν σε ζωντανά έμβρυα. Τέλος, οι μετρήσεις Παραγωγής Τρίτης Αρμονικής αποδίδουν μοναδικές, υψηλής διακριτικής ικανότητας, μορφολογικές πληροφορίες και παρέχουν μία ποιοτική περιγραφή της δυναμικής εσωτερικών δομών σε wild type και μεταλλαγμένα (mutants) έμβρυα ή μοντέλα οργανισμούς.
(EL)
Two Photon Fluorescence (TPEF), Second Harmonic Generation (SHG) and Third Harmonic Generation (THG) are relatively new imaging tools for the imaging of biological structures and processes at the microscopic level. The combination of TPEF, SHG, and THG imaging contrast modes in a single instrument provides unique and complementary information concerning the structure and the function of tissues and individual cells. In the present study, a useful, reliable, compact set-up for the in vivo simultaneous TPEF, SHG and THG imaging of biological samples, was developed.
By means of the developed setup, high-resolution (~200nm) mapping of the nematode C. elegans in both its anterior and posterior body part was achieved. Unique information related the structure and the functions of tissues and cells of the nematode were extracted. Numerous strains were investigated. Wild type, mutants expressing GFP (membrane localized or cytoplasmic) in mechanoreceptor neurons, mutants expressing diffuse GFP in the pharyngeal cytoplasm and expressing diffuse DSRED in the head and motor neurons. Optimum conditions for the detection of THG signal, arising from the worm, were found. Detailed and specific structural and anatomical features can be visualized, by recording THG signals. This is the first time that a THG modality is employed to image live C. elegans specimens.
Additionally, by performing THG measurements, neurodegeneration phenomena were investigated. The in vivo precise identification of the shape and the contour of the degenerative neurons in the posterior part of the nematode and the monitor, in real time, of the evolution of the degenerative neurons of the worm through THG imaging measurements were achieved.
The development and optimization of a user friendly and compact prototype microscope system that combines three different nonlinear image-contrast modes (TPEF-SHG-THG) in a single instrument will be useful for a variety of applications in the field of biology and medicine. It offers new insights into the studies of embryonic morphological changes and complex developmental processes. The excellent 3D resolution capacity of these non linear techniques allows us to capture the subtle developmental information on the cellular or subcellular levels occurring deep inside the live larvae. Moreover, THG imaging measurements provide a quantitative description of the dynamics of internal structures in unstained wild type and mutant embryos and model organisms.
(EN)
