Η γλουταμική αφυδρογονάση (GDH), ένα ένζυμο με σημαίνοντα ρόλο στο
μεταβολισμό του γλουταμικού, θεωρείται πως εντοπίζεται στα μιτοχόνδρια, μολονότι
νεότερες μελέτες έδειξαν εντόπιση ισομορφής της GDH στο ενδοπλασματικό δίκτυο,
στα λυσοσώματα, σε κυτταροπλασματικές μεμβράνες/κυστίδια ή ακόμη και στον
πυρήνα. Στον άνθρωπο υπάρχει σε δύο ισομορφές. Η πρώτη (hGDH1) κωδικοποιείται
από το γονίδιο GLUD1, το οποίο εκφράζεται σε όλους τους ιστούς (house-keeping),
περιέχει 13 εξόνια και χαρτογραφείται στο ανθρώπινο χρωμόσωμα 10. Η δεύτερη
(hGDH2) κωδικοποιείται από ένα φυλοσύνδετο μη περιέχων ιντρόνια γονίδιο
(GLUD2), το οποίο εκφράζεται ειδικώς στο νευρικό σύστημα και στους όρχεις. Η
wild type hGDH1είναι θερμοανθεκτική και έχει σημαντική βασική δραστηριότητα
(40-45% της μεγίστης) απουσία αλλοστερικών τροποποιητών. Αναστέλλεται όμως
ισχυρά από το GTP σε σχετικά χαμηλές συγκεντρώσεις GTP (IC50 = 0,3 μΜ),
ανάλογες αυτών που υπάρχουν υπό φυσιολογικές συνθήκες στους μη νευρικούς
ιστούς, καθιστώντας το GTP ρυθμιστή της δραστικότητας της GDH στους
περιφερικούς ιστούς. Η wild type hGDH2 είναι θερμοασταθής, εμφανίζει χαμηλή
βασική δραστηριότητα (5-10 % της μεγίστης) και δεν αναστέλλεται από το GTP, του
οποίου τα επίπεδα στο νευρικό ιστό είναι υψηλότερα. Ενεργοποιείται πλήρως σε
αυξημένες συγκεντρώσεις ADP και ως εκ τούτου λειτουργεί κυρίως όταν υπάρχει
αυξημένη κατανάλωση κυτταρικής ενέργειας (υψηλά επίπεδα ADP), όπως επί
έντονης διεγερτικής νευροδιαβίβασης. Επίσης η λευκίνη δρα ως αλλοστερικός
ενεργοποιητής σε μεγαλύτερο ποσοστό της wild type hGDH2 απ’ ότι της wild type
hGDH1, γεγονός που γίνεται εντονότερο παρουσία μικρών συγκεντρώσεων ADP
(συνέργεια ADP και λευκίνης). Οι διαφορές των δύο ισοενζύμων μελετήθηκαν με μ
μεταλλαξιογένεση σε θέσεις στις οποίες διαφέρουν και βρέθηκε πως δύο
αντικαταστάσεις αμινοξέων ευθύνονται για τις σημαντικότερες διαφορές μεταξύ των
wild type hGDH1 και wild type hGDH2. Η αντικατάσταση της Gly 456 από Ala
προσδίδει την ανθεκτικότητα στο GTP. Η δεύτερη αντικατάσταση (Arg443 από Ser)
ελαχιστοποιεί την βασική δραστικότητα (~3% της μεγίστης) αλλά επιτρέπει την
πλήρη ενεργοποίηση του ενζύμου με ADP και επιπλέον αποτρέπει την ενεργοποίηση
από τη λευκίνη. Παρουσία όμως μικρών συγκεντρώσεων ADP (0.025-0.1 mM) στις
οποίες μόνο του το ADP ελάχιστα ενεργοποιεί το ένζυμο (<10 % της μεγίστης
δραστηριότητας), παρατηρείται αύξηση της δραστηριότητας έως και >2,000 %. Τέλος
η Arg443 φαίνεται πως είναι υπεύθυνη για την ευαισθησία στη θερμική
αδρανοποίηση της wild type hGDH2. Η Arg443 βρίσκεται στην μικρή έλικα της
κατερχόμενης αλυσίδας της antenna και συνδέεται με δεσμούς υδρογόνου με τη Ser
409 της ανερχόμενης α-έλικας της antenna γειτονικής υπομονάδας.
Με σκοπό να εμβαθύνουμε περαιτέρω στον τρόπο ρύθμισης της wild type
hGDH2 δημιουργήσαμε αρχικώς 2 μεταλλαγμένες ισομορφές με αντικατάσταση της
Ser409 με Arg ή Asp. H Ser409Arg μεταλλαγμένη hGDH1 εμφάνισε πολύ χαμηλή
βασική ειδική δραστηριότητα (2.7 % της μεγίστης), παρουσίαζε σημαντική
ανθεκτικότητα στη δράση του ADP (SC50 =127.5±4.1 μM) και ήταν ανθεκτική στην
ενεργοποίηση από λευκίνη απουσία ADP. Μολαταύτα η παρουσία χαμηλών
συγκεντρώσεων ADP (25-100μΜ) ευαισθητοποιούσε το μεταλλαγμένο ένζυμο στη
δράση της λευκίνης (συνεργική δράση ADP-λευκίνης). Υιοθετούσε δηλαδή την
συμπεριφορά της μεταλλαγμένης Arg443Ser hGDH1 και προσομοιάζει στον τρόπο
ενεργοποίησης της hGDH2. Μολαταύτα ήταν απρόσμενα ανθεκτική στη θερμική
αδρανοποίηση (χρόνος ημίσειας ζωής = 239.7 min) και σημαντικά πιο ευαίσθητη σε
σύγκριση με την wild type hGDH1 (αλλά και την Arg443Ser μεταλλαγμένη hGDH1)
στην αναστολή από το GTP. Η Ser409Asp μεταλλαγμένη hGDH1 εμφάνιζε χαμηλή
βασική δραστηριότητα (3-5 % της μεγίστης) και σημαντικά μικρότερη ανθεκτικότητα
στην ενεργοποίηση από λευκίνη, ενώ διαπιστώνεται συνέργεια μεταξύ ADP και L-
λευκίνης μόνο σε χαμηλές συγκεντρώσεις ADP. Ενεργοποιούνταν από το ADP με
τρόπο ομοιάζοντα περισσότερο στη wild-type hGDH1 και εμφάνιζε ανθεκτικότητα
στην αναστολή από το GTP προσεγγίζοντας τη συμπεριφορά της wild-type hGDH2.
Τα ανωτέρω αποτελέσματα επιβεβαιώνουν πως η βασική αιτία της χαμηλής βασικής
δραστηριότητας της wild-type hGDH2 οφείλεται στην αλληλεπίδραση της Arg443
μίας υπομονάδος με την Ser409 γειτονικής υπομονάδας μέσω δεσμών Η, που
αποτελεί το κριτικό γεγονός για το άνοιγμα/κλείσιμο της καταλυτικής σχισμής.
Επιπλέον επιβεβαιώνεται πως η λευκίνη συνδέεται εντός του ενεργού κέντρου και
συνεπώς απαραίτητη συνθήκη για τη δράση της αποτελεί η διάνοιξη της καταλυτικής
σχισμής, γεγονός που επιτελείται με την αλληλεπίδραση Arg443 και Ser409.
Η διπλά μεταλλαγμένη R443S/G456A hGDH1 που κατασκευάσαμε
αναπαρήγαγε τις διαφορές που παρατηρούνται μεταξύ hGDH1 και hGDH2.
Συγκεκριμένα εμφάνισε χαμηλή βασική δραστηριότητα (0.25% της μεγίστης), ήταν
ευαίσθητη στη θερμότητα με χρόνο ημίσειας ζωής = 16.5 minutes, ήταν ~3 φορές πιο
ανθεκτική στην ενεργοποίηση από το ADP σε σχέση με την wild type hGDH2 και
επέδειξε παρόμοια με την wild type hGDH2 συμπεριφορά στην ανθεκτικότητα
αναστολής από το GTP παρουσία ADP, ενώ απουσία αλλοστερικού ενεργοποιητή
ήταν 8 φορές ανθεκτικότερη στη δράση του. Συνοπτικά υιοθετούσε συμπεριφορά
ενδιάμεση της Arg443Ser μεταλλαγμένης hGDH1 και της hGDH2 και παρότι η διπλά
μεταλλαγμένη R443S/G456A hGDH1 αποτελεί την καλύτερη έως σήμερα
προσομοίωση της wild-type hGDH2 δεν ταυτίζεται με αυτήν.
Τέλος μελετήσαμε την υποκυτταρική εντόπιση της γλουταμικής
αφυδρογονάσης με παροδική συν-διαμόλυνση των κυτταρικών σειρών COS 7, HeLa,
CHO, HEK 293 και SH-SY5Y (κυττάρων νευροβλαστώματος) με το χιμαιρικό
πλασμίδιο pEGFP-N3-GLUD1 (ή GLUD2) και με 3 πλασμιδιακούς φορείς τους
pDsRed2-Μitο, pDsRed2-Nuc και pDsRed2-ER -δείκτες υποκυτταρικής εντόπισης για
συγκεκριμένα κυτταρικά οργανύλλια (μιτοχόνδρια, πυρήνας και ενδοπλασματικό
δίκτυο αντιστοίχως). Σε όλες τις κυτταρικές σειρές που εξετάστηκαν και οι δύο
ισομορφές hGDH1 και hGDH2 εντοπίζονται κατά κύριο λόγο στα μιτοχόνδρια. Σε
μικρότερο ποσοστό εντοπιζόταν στο ενδοπλασματικό δίκτυο ανθρώπινων σωματικών
και νευρικών κυττάρων, ενώ δεν υφίσταται πυρηνική μορφή GDH.
(EL)
Glutamate dehydrogenase (GDH), an enzyme central to glutamate
metabolism, is located in the mitochondria. In addition, there is evidence for extramitochondrial
localization of GDH. Human GDH exists in housekeeping (hGDH1)
and nerve tissue-specific (hGDH2) isoenzymes encoded by the GLUD1 and the
GLUD2 genes respectively, which differ markedly in their basal activity, allosteric
regulation and thermal stability. hGDH2 is thermolabile, shows low basal activity that
is fully restored by ADP albeit at higher concentrations than hGDH1, is more
sensitive to L-leucine activation and to the synergistic effect of ADP and L-leucine
and resistant to GTP inhibition. Site directed mutagenesis of GLUD1 revealed that
replacement of Gly456 by Ala made the enzyme resistant to GTP without altering its
regulation by ADP. In addition substitution of Ser for Arg443 (which lies in the
antenna region of GDH) virtually abolished basal activity, made the enzyme
extremely sensitive to heat inactivation and totally abrogated the activation of the
enzyme by L-Leucine. However the presence of low concentrations of ADP (0.025-
0.1 mM) permitted the activation of the mutant by L-leucine. Structural modeling
implicated that the replacement of Arg443 by Ser may disrupt the H-bond(s) between
Arg443 and Ser409 (part of the ascending strand of the antenna) from an adjacent
subunit and thus may result in closure of the active catalytic cleft. Substitution of the
Ser409 for Arg rendered the enzyme virtually inactive at baseline and resistant to Lleucine
activation. ADP fully restored the activity of mutant and made it sensitive to
L-leucine activation. On the other hand, replacement of Ser409 by Asp had a lesser
effect on basal activity and to L-leucine activation than Arg substitution. Hence, these
data confirm that interaction of adjacent subunits through the Arg443 and Ser409
residues plays a crucial role in setting the basal activity levels. Abrogation of Lleucine
activation by R443S, S409R or S409D mutants is consistent with the concept
that these mutations lead to a closed conformation, which hinders access of L-leucine
to the catalytic site for it action. Since the S409R hGDH1 mutant was insensitive to
heat denaturation, the interaction between the two residues does not seem to be
responsible for heat sensitivity. In addition both S409R and S409D hGDH1 mutants
showed a differential response to GTP inhibition, with the former being more
sensitive and the latter more resistant to GTP in comparison to the wt hGDH1.
Moreover, we created a double hGDH1 mutant that had both Arg443Ser and
Gly456Ala in the same polypeptide chain. Functional analyses revealed that the
doubly mutated enzyme had similar properties but did not acquire all the
characteristics of the wild-type hGDH2. Subcellular localization studies were
performed using expression vectors for hGDH1 and hGDH2 fused with the enhanced
green fluorescence protein (EGFP) that transiently transfected COS 7, HeLa, CHO,
HEK 293 and neuroblastoma cell lines. When the cultured cells were transfected with
EGFP-tagged hGDH1 or hGDH2, confocal microscopy demonstrated localization of
the fluorescence in the cytoplasmic region within coarse structures resembling
mitochondria. Co-transfection experiments using a mixture of hGDH1-EGFP (or
hGDH2-EGFP) vector and the pDsRed2-Mito vector (a mitochondrial marker)
showed an identical fluorescence pattern in merged pictures, thus confirming the
mitochondrial localization of both human GDHs. In addition, a small fraction of the
hGDH1 (or hGDH2) was found to co-localize with endoplasmic reticular marker
pDsRed2-ER. There was no evidence for the nuclear or cytoplasmic localization of
either GDH isoforms. Our results elucidate further the properties that allow the brain
isoenzyme to function well under the special conditions prevailing in the human
Central Nervous System.
(EN)