Οι λεπτές μεμβράνες (ΛΜ) που καλύπτουν τους πόρους μεταξύ των ποδικών εκβλαστήσεων (ΠΕ) γειτονικών ποδοκυττάρων είναι βασικές δομές του σπειραματικού ηθμού όπου γίνεται η υπερδιήθηση του πλάσματος στο νεφρικό σπείραμα.
Πιθανή διαταραχή στις ΛΜ και στα βασικά συστατικά τους, τη νεφρίνη και την ποδοσίνη, ενέχεται στην παθογένεια της σπειραματονεφρίτιδας με πρωτεϊνουρία που οφείλεται σε ανοσολογικούς μηχανισμούς. Διεξήγαμε μελέτη σε πειραματόζωα και σε ανθρώπους με σκοπό να καθορίσουμε της έκφραση της νεφρίνης και της ποδοσίνης στις διάφορες ιστολογικές μορφές της νεφρίτιδας του λύκου (ΝΛ), μια νόσο πρότυπο για τις νεφρίτιδες με αυτοάνοση αρχή, της οποίας χαρακτηριστική κλινική εκδήλωση είναι η πρωτεϊνουρία.
Οι νεφροί εξετάστηκαν με φωτονικό μικροσκόπιο (ΦΜ) και με ανοσοφθορισμό ΙgG για να προσδιοριστούν τα χαρακτηριστικά της ΝΛ. Η εξέταση συμπληρώθηκε και με ηλεκτρονική μικροσκοπία. Βασιζόμενοι στα ευρήματα από την εξέταση με το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο, προσδιορίσαμε στη συνέχεια τη σπειραματική έκφραση της ολικής νεφρίνης και ποδοσίνης σε πρωτεϊνικό επίπεδο με ανάλυση western blot σε θηλυκά NZB/W ποντίκια, φυσιολογικά στο ΦΜ (n=11), με ήπια μεσαγγειακή υπερπλασία (ΗΜΝΛ) (n=5), με εστιακή (ΕΥΝΛ) (n=6) και διάχυτη υπερπλαστική νεφρίτιδα (ΔΥΝΛ) (n=4) καθώς και σε ποντίκια C57BL/6 (n=24) αντίστοιχης ηλικίας και φύλου που αποτέλεσαν την ομάδα ελέγχου, όπως επίσης και σε NZB (n=5) και NZW (n=4) ποντίκια. Η έκφραση της νεφρίνης εξετάστηκε επίσης με ανοσοφθορισμό στα παρασκευάσματα του νεφρικού ιστού. Για να προσδιορίσουμε εάν οι μεταβολές της νεφρίνης και της ποδοσίνης οφείλονται σε μεταβολή της μεταγραφής των αντίστοιχων γονιδίων, προσδιορίσαμε το mRNA στα ίδια δείγματα, με ποσοτική αντίστροφη real time PCR. Προκειμένου να επιβεβαιώσουμε τα ευρήματα μας στα πειραματόζωα εξετάσαμε με ανοσοϊστοχημεία την έκφραση της νεφρίνης σε ασθενείς με διάφορους τύπους ΝΛ: τάξης II (n=5), IV (n=4), V (n=7) και σε υγιείς μάρτυρες (n=2).
Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (SEM). Για τις συγκρίσεις χρησιμοποιήθηκαν οι έλεγχοι Mann-Whitney U-test (αριθμητικές μεταβλητές) και το Fisher's exact test (κατηγορικές μεταβλητές).
Οι μεταβολές στα ΛΔ, όπως προσδιορίστηκαν με την εξέταση στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο συσχετίζονται με την ιστολογική εικόνα στα θηλυκά NZB/W ποντίκια. Η σοβαρότητα των μεσαγγειακών, υπό-ενδοθηλιακών και υπό-επιθηλιακών εναποθέσεων, καθώς και η εξάλειψη των ΠΕ συσχετίζονταν σημαντικά με την 24ωρη πρωτεϊνουρία. (ρ=0.85, p<0.003) και την ένταση του ανοσοφθορισμού IgG (ρ=0.90, p<0.001). Η αναλύσεις με Western blot και ανοσοφθορισμό ανέδειξαν σημαντικά μειωμένα επίπεδα νεφρίνης στα ποντίκια με ΕΥΝΛ ή ΔΥΝΛ (p<0.05 για όλες τις ανά ζεύγη συγκρίσεις). Τα επίπεδα ποδοσίνης ήταν επίσης σημαντικά μειωμένα στις ίδιες ομάδες ποντικιών (p<0.05). Τα επίπεδα και των δύο πρωτεϊνών ήταν σημαντικά μειωμένα στα ποντίκια NZB/W με εκτεταμένη εξάλειψη ΠΕ (p<0.05 και για τις δύο). Τα επίπεδα του σπειραματικού mRNA της νεφρίνης και της ποδοσίνης ήταν σημαντικά μειωμένα στην ΔΥΝΛ - αλλά όχι στη ΕΥΝΛ (p=0.034). Βρήκαμε καλή συσχέτιση μεταξύ των επίπεδων mRNA νεφρίνης και ποδοσίνης σε όλα τα ποντίκια NZB/W (ρ=0.77, p<0.001). Από τα ποντίκια γονείς, ένα NZB ποντίκι παρουσίασε ΕΥΝΛ ενώ όλα τα υπόλοιπα NZB και όλα τα NZW ποντίκια παρουσίασαν φυσιολογικά ευρήματα στο φωτονικό μικροσκόπιο. Εντούτοις όλα εκδήλωσαν σημαντική πρωτεϊνουρία στο 24ώρο. Τα επίπεδα ποδοσίνης ανευρέθηκαν μειωμένα στα NZB και NZW σε σύγκριση με τα NZB/W που έχουν φυσιολογική ιστολογία στο φωτονικό μικροσκόπιο (p= 0.024 , p=0.030 respectively) και εικόνα με ΗΜΝΛ (p=0.034 για NZB και NZW). Στις ανθρώπινες βιοψίες, σημαντικά περισσότεροι ασθενείς με ΔΥΝΛ παρουσίαζαν μειωμένη έκφραση νεφρίνης σε σύγκριση με τους ασθενείς με ΝΛ τάξης II ή V LN (p < 0.05).
Η μελέτη μας αποτελεί την πρώτη συνοπτική ανάλυση που αφορά την έκφραση της νεφρίνης και της ποδοσίνης σε πειραματόζωα και ανθρώπους με ΝΛ. Οι παραπάνω πρωτεΐνες προσδιορίζονται σε πρωτεϊνικό επίπεδο και σε επίπεδο mRNA και τα ευρήματα διασταυρώνονται με ανοσοφθορισμό στις βιοψίες. Βρήκαμε ότι τα επίπεδα της νεφρίνης στο σπείραμα ήταν μειωμένα κατά σχεδόν 50% στην ήπια ΝΛ (ΗΜΝΛ) και πολύ μειωμένα σε σοβαρότερες μορφές της νόσου (ΕΥΝΛ/ΔΥΝΛ). Τα επίπεδα της ποδοσίνης είναι επηρεασμένα μόνο στις πιο σοβαρές μορφές της νόσου (ΕΥΝΛ/ΔΥΝΛ). Οι μεταβολές στη νεφρίνη και στην ποδοσίνη σχετίζονται με τη σοβαρότητα της ιστολογικής εικόνας. Τα παραπάνω ευρήματα σε συνδυασμό με τα εξίσου σημαντικά μειωμένα επίπεδα σπειραματικού mRNA των αντίστοιχων πρωτεϊνών στα μόνο πιο προχωρημένα στάδια της νόσου (ΔΥΝΛ), ίσως υποδηλώνουν ότι οι μεταβολές στις ΛΜ συμβαίνουν καταρχήν σε επίπεδο πρωτεΐνης και ακολούθως σε επίπεδο μεταγραφής της πρωτεΐνης. Οι μέχρι τώρα θεωρούμενοι φυσιολογικοί γονείς των NZBW και ιδιαιτέρως τα άρρενα ποντίκια NZW παρουσίαζαν στη μελέτη μας δομικές αλλοιώσεις των ΑΜ που σχετίζονταν με μειωμένα επίπεδα ποδοσίνης. Το εύρημα αυτό πιθανά σχετίζεται με την προδιάθεση των απογόνων τους NZB/W για νεφρική βλάβη. Βρήκαμε επίσης σημαντικά μειωμένη έκφραση νεφρίνης σε ασθενείς με τάξης IV υπερπλαστική νόσο σε σχέση με ασθενείς με τάξης V νεφρίτιδα παρά το γεγονός ότι και οι δύο έχουν συγκρίσιμα ποσά πρωτεϊνουρίας. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώνουν τα ευρήματά μας στα πειραματόζωα προτείνοντας ότι τα επίπεδα της νεφρίνης συσχετίζονται καλύτερα με την ιστολογική τάξη της νεφρίτιδας παρά με το βαθμό της πρωτεϊνουρίας. Τα ευρήματά μας υπαινίσσονται ένα νέο ρόλο των ποδοκυττάρων και των δομών τους στη σπειραματονεφρίτιδα ανοσολογικής αρχής.
(EL)
The slit diaphragms (SD) that cover the slit pores among adjacent foot processes (FP) of the podocytes are crucial constituent of the primary barrier for ultrafiltration of plasma in renal glomeruli.
A putative distraction of the SDs, of its main components, nephrin and podocin is involved in the immune mediated glomerulonephritis with proteinuria. We undertook an animal and human study to determine the expression of nephrin and podocin in the various forms of lupus nephritis (LN), a prototype of autoimmune disease with a various histological and clinical picture with proteinuria been a major clinical manifestation.
The kidneys were examined by light microscopy (LM), and IgG immunofluorescence in order to determine the LN characteristics. Electron microscopy was also performed. In view of electron microscopy findings, we next assessed the glomerular expression of total nephrin and podocin at the protein level by western blot analysis in normal (n=11), MMLN: mild mesangial hyperplasia (n=5), FPLN: focal (n=6) and DPLN: diffuse (n=4) proliferative nephritis in NZB/W females and of age and sex matched C57BL/6 controls (n=24) as well as in NZB (n=5) and NZW (n=4) mice. Nephrin expression was also examined by immunofluorescence in kidney biopsy specimens. To determine whether alterations to protein expression of nephrin and podocin are due to altered transcription of the corresponding genes, we performed quantitative real-time PCR in the same kidney samples. In order to verify our findings in murine LN we performed immunohistochemistry for nephrin expression in renal tissue from patients with various classes of LN: class II (n=5), IV (n=4), V (n=7) and healthy controls (n=2).
Data are expressed as the mean ± standard error of the mean (SEM) value. Comparisons were performed with the Mann–Whitney U-test (numerical data) or the Fisher‟s exact test (categorical data).
The SD alterations determined by electron microscopy correlate with histology in NZB/W F1 mice. The severity of mesangial, subendothelial and subepithelial deposits, as well as FP effacement findings were significantly associated with 24-hr proteinuria (ρ = 0.85, p<0.003)
6
and IgG intensity (ρ = 0.90, p<0.001). Western blot and immunofluorescence showed significantly reduced nephrin protein expression in mice with FPLN or DPLN (p<0.05 for all pair-wise comparisons). Podocin protein expression was also significantly decreased in the same groups (p<0.05). Both proteins were significantly reduced in NZB/W mice with extensive FP effacement (p<0.05 for both). Glomerular nephrin and podocin mRNA levels were significantly reduced in DPLN - but not in FPLN - (p=0.034). We found a good correlation between glomerular nephrin and podocin mRNA levels in all NZB/W mice (ρ = 0.77, p<0.001). One NZB mouse showed focal proliferative nephritis while the rest NZB mice and all the NZW mice showed normal LM findings however, they exhibit significant 24-hr proteinuria. Podocin protein was reduced in the NZB and in the NZW as compared to NZB/W with normal LM findings (p= 0.024, p=0.030 respectively) and with MMLN (p= 0.034 for both NZB and NZW). Significantly more patients with DPLN had reduced nephrin expression as compared to patients with class II or V LN (p<< 0.05).
Our study represents the first comprehensive analysis of podocin and nephrin expression at protein and mRNA level coupled with immunofluorescence findings in murine and human LN. Glomerular nephrin protein levels were reduced by almost 50% in mild LN (MMLN) and became diminished at more advanced stages (FPLN/DPLN). Podocin is affected only in the most serious forms of the disease (FPLN/DPLN). Nephrin and podocin protein expression correlate with the severity of the disease histology. This coupled with the significant reduction of nephrin and podocin glomerular mRNA only in the most advanced stages (DPLN) may imply that the SD alterations at the protein level precede the alterations in the mRNA level. The mRNA level is finally affected only in the most sever forms of the disease. The previously regarded healthy ancestors of the NZB/W, especially the males NZW were found with ultrastructural SD alterations regarding reduced podocin which might is a co-factor contributing to NZB/W predisposition to renal disease. We found significantly reduced nephrin expression in patients with class IV proliferative disease as compared to class V patients, despite both groups having comparable levels of proteinuria. These results confirm our findings in murine LN, suggesting that nephrin expression correlates better with the histological class than with the level of proteinuria. Our findings suggest a novel role of podocytes and their structures in immune-mediated nephritis.
(EN)
