Δημιουργία ανασυνδυασμένων αδενοϊών που εκφράζουν τις απολιποπρωτεiνες A-IV και A-II

 
Το τεκμήριο παρέχεται από τον φορέα :
Πανεπιστήμιο Κρήτης
Αποθετήριο :
E-Locus Ιδρυματικό Καταθετήριο
δείτε την πρωτότυπη σελίδα τεκμηρίου
στον ιστότοπο του αποθετηρίου του φορέα για περισσότερες πληροφορίες και για να δείτε όλα τα ψηφιακά αρχεία του τεκμηρίου*
κοινοποιήστε το τεκμήριο



Construction of recombinant adenoviruses expressing the apolipoproteins A-IV and AII
Δημιουργία ανασυνδυασμένων αδενοϊών που εκφράζουν τις απολιποπρωτεiνες A-IV και A-II

Τζαβλάκη, Καλλιόπη

Καρδάσης, Δημήτρης

Οι απολιποπρωτεΐνες είναι δομικά συστατικά των λιποπρωτεΐνών. Ένα κοινό χαρακτηριστικό της πλεονότητας των απολιποπρωτεϊνών η παρουσία αμφιπαθικών α-ελίκων στη δευτεροταγή δομή τους. Οι αμφιπαθικές αυτές έλικες είναι σημαντικές για την ικανότητα των απολιποπρωτεϊνών να δεσμεύουν λιπίδια. Πέρα όμως από αυτή την ιδιότητα, κάθε απολιποπρωτεΐνη φέρει και κάποια μοναδικά χαρακτηριστικά ώστε να συμμετέχει ενεργά σε διάφορα βήματα των μονοπατιών σύνθεσης και καταβολισμού λιποπρωτεϊνών. Όλα τα παραπάνω χαρακτηριστικά κάνουν επιτακτική την ανάγκη μελέτης των απολιποπρωτεϊνών τόσο in vitro όσο και in vivo. Ενώ η απολιποπρωτεΐνη Α-Ι η οποία αποτελεί βασικό δομικό συστατικό των λιποπρωτεϊνών υψηλής πυκνότητας (HDL) έχει μελετηθεί εκτενώς όσον αφορά τη δράση της στο μονοπάτι σχηματισμού της HDL, οι απολιποπρωτεΐνες Α-ΙV και Α-ΙΙ οι οποίες επίσης αποτελούν σε σημαντικό ποσοστό δομικά συστατικά των λιποπρωτεϊνών υψηλής πυκνότητας. Οι συγκεκριμένες απολιποπρωτεΐνες δεν έχουν διερευνηθεί πλήρως και η μελέτη της δράσης τους περιορίζεται κυρίως σε in vitro προσεγγίσεις μέχρι στιγμής. Στο πρώτο μέρος, η παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή είχε ως στόχο τη δημιουργία ανασυνδυασμένων αδενοϊών που θα εκφράζουν τις απολιποπρωτεΐνες Α-ΙΙ και A-IV. Οι συγκεκριμένοι αδενοϊοί στη συνέχεια θα χρησιμοποιηθούν για την in vivo και in vitro μελέτη της δράσης των απολιποπρωτεϊνών αυτών σε πειραματόζωα. Από αυτές τις μελέτες αναμένεται να αποσαφηνιστεί ο τρόπος δράσης των συγκεκριμένων απολιποπρωτεϊνών in vivo. Στο δεύτερο μέρος, σημαντικός στόχος αυτής της μεταπτυχιακής διατριβής ήταν η δημιουργία μιας μορφής της απολιποπρωτεΐνης Α-Ι που να μπορεί να βιοτινυλιωθεί με απώτερο στόχο την ευκολότερη απομόνωση της HDL από το ποντίκι. Καθώς η apoA-I αποτελεί μία εκκρινόμενη πρωτεΐνη, για την επίτευξη του παραπάνω στόχου καθοριστικής σημασίας ήταν η δημιουργία μιας μορφής της apoA-I που έφερε τον επίτοπο Bio καθώς και μιας εκκρινόμενης μορφής της λιγάσης της βιοτίνης BirA, η οποία έχει την ιδιότητα να βιοτινυλιώνει πρωτεΐνες που φέρουν τον επίτοπο Bio. H συνέκφραση της εκκρινόμενης BirA και της Βio-apoA-I σε κύτταρα της σειράς HEK 293T οδήγησε τελικά στην βιοτινυλίωση της apoA-I. Μελλοντικά θα κατασκευαστoύν αδενοϊοί που θα εκφράζουν την συγκεκριμένη μορφή της apoA-I που μπορεί να βιοτινυλιωθεί από την BirA και την εκκρινόμενη μορφή της BirA. Η μόλυνση ποντικών με τους συγκεκριμένους αδενοϊούς θα επιτρέψει το σχηματισμό HDL σωματιδίων στο πλάσμα που θα περιέχουν την βιοτινυλιωμένη μορφή της apoA-I. Η μέθοδος αυτή θα επιτρέψει την ευκολότερη απομόνωση της HDL από το πλάσμα των μολυσμένων ποντικών χρησιμοποιώντας χρωματογραφία συγγένειας και πιο συγκεκριμένα χρησιμοποιώντας σφαιρίδια στρεπταβιδίνης-σεφαρόζης τα οποία προσδένουν βιοτίνη με μεγάλη συγγένεια και εξειδίκευση. Ο απώτερος στόχος είναι η μελέτη της δομής και της σύστασης της HDL που σχηματίζεται από μεταλλαγμένες μορφές πρωτεϊνών που συμμετέχουν στην βιογένεση και τον μεταβολισμό της όπως οι απολιποπρωτεΐνες A-I, A-II A-IV και Ε, και τα ένζυμα του πλάσματος όπως η LCAT, η CETP και άλλα. Πολυάριθμες επιδημιολογικές μελέτες έχουν αποδείξει ότι τα χαμηλά επίπεδα της HDL στο πλάσμα αποτελούν έναν ανεξάρτητο παράγοντα κινδύνου για την ανάπτυξη της αθηρωμάτωσης. Κατανοώντας τη σχέση μεταξύ δομής και λειτουργίας της HDL μέσω της μελέτης των πρωτεϊνών που συμμετέχουν στον σχηματισμό της θα κατορθώσουμε να αναπτύξουμε νέες στρατηγικές για τη θεραπεία των δυσλιπιδαιμιών του ανθρώπου που χαρακτηρίζονται από τη μη λειτουργική HDL. (EL)
The protein components of lipoproteins are apolipoproteins. Αn important trait of most of the apolipoproteins is the presence of amphipathic α-helices in their secondary structure. The amphipathic α-helices contribute to the lipid-binding properties of the apolipoproteins. In addition to their lipid-binding functions, the apolipoproteins participate to the lipoprotein pathways due to several other characteristics they possess. In order to investigate the different properties of the apolipoproteins, in vitro and in vivo studies should be performed. Apolipoprotein A-I is the major protein constituent of high density lipoproteins (ΗDL) and has been extensively studied in vitro and in vivo as it plays a crucial role in the HDL biogenesis pathway. ApoA-II and apoA-IV are also important protein constituents of HDL and also participate in the HDL biogenesis pathway. However, the physiological role and the functionality of these two apolipoproteins has not yet been completely understood and more in vivo studies should be designed and performed for this purpose. In the first part of this study, we created two recombinant adenoviruses expressing the apolipoproteins A-II and A-IV respectively. These recombinant adenoviruses are going to be used for studying the properties of apoA-II and apoA-IV both in vitro and in vivo. We expect that these studies will enlighten us about the functions of these apolipoproteins. In the second part of this study, we tried to create a form of apoA-I that could be biotinylated. This way HDL particles will be easily isolated from the blood during in vivo studies. In order to successfully biotinylate a secreted protein, apoA-I in this case, we created a form of apoA-I fused with the Bio-epitope and a secreted form of the biotin ligase BirA that successfully biotinylates proteins tagged to the Bio-epitope. The cotransfection of the secreted BirA construct along with the bio-apoA-I construct into HEK 293 T cells enabled the biotinylation of the secreted apolipoprotein A-I. In the future, recombinant adenoviruses expressing this particular form of apoA-I and the secreted form of BirA are going to be constructed. We expect that the infection of mice with these adenoviruses will lead to the formation of HDL particles that will contain biotinylated apoA-I. This way, HDL particles will be easily isolated from the blood plasma of infected mice using high affinity chromatography and more especially Streptavidin-Sepharose beads as these beads bind biotin with very high affinity. This method will contribute to the extensive study of the structure and the composition of HDL particles that are formed when mutated forms of the A-I, A-II, A-IV and E apolipoproteins are involed in the HDL biogenesis pathway. The results of multiple epidemiological studies show that the low HDL levels in blood plasma are considered as a strong independent risk factor for atherosclerotic vascular disease. The study of different proteins that are involed in the HDL biogenesis pathway will enlighten us about the relationship between the structure and the function of HDL and will hopefully lead us to the development of new strategies concerning the gene therapy of different dyslipidemias. (EN)

text

Lipoproteins
Recombinant adenoviruses
Λιποπρωτεΐνες
Apolipoproteins

Πανεπιστήμιο Κρήτης (EL)
University of Crete (EN)

2009-04-07




*Η εύρυθμη και αδιάλειπτη λειτουργία των διαδικτυακών διευθύνσεων των συλλογών (ψηφιακό αρχείο, καρτέλα τεκμηρίου στο αποθετήριο) είναι αποκλειστική ευθύνη των αντίστοιχων Φορέων περιεχομένου.