Η ελονοσία αποτελεί ένα από τα βασικότερα προβλήματα της παγκόσμιας υγείας, αφού κοστίζει τη ζωή σε περισσότερους από ένα εκατομμύριο θανάτους ετησίως, ενώ 300 εκατομμύρια άνθρωποι νοσούν. Προκαλείται από παράσιτα του γένους Plasmodium και μεταφέρεται από κουνούπια του γένους Anopheles. Η ελονοσία πλήττει κυρίως την Αφρική, νότια της ερήμου Σαχάρας, όπου και παρατηρείται το 90% των περιστατικών και πιστεύεται ότι στα προσεχή χρόνια, το φαινόμενο θα ενταθεί και επεκταθεί και σε άλλες περιοχές της Αφρικής και της Ευρώπης, εφόσον οι παραδοσιακές μέθοδοι καταπολέμησης δεν επαρκούν. Για το λόγο αυτό η επιστήμονες στρέφονται στην ανεύρεση νέων εναλλακτικών μεθόδων. Είναι γνωστό ότι ο βιολογικός κύκλος του παρασίτου περιλαμβάνει πολλά στάδια, μεταξύ αυτών και του ωοκινέτη, μια κινητής μορφής με την οποία εισβάλλει στο επιθήλιο του μεσεντέρου του κουνουπιού, το διαπερνά και στη συνέχεια, ερχόμενο σε επαφή με την βασική λεπίδα του επιθηλίου, σταματά και διαφοροποιείται σε ωοκύστη. Στο στάδιο αυτό, τα παράσιτο, φυσιολογικά, έχει σημαντικές αριθμητικές απώλειες, επομένως εξυπηρετεί τον σκοπό της καταπολέμησης του. Για το λόγο αυτό πολλές επιστημονικές έρευνες αποσκοπούν στην μελέτη και κατανόηση σε μοριακό και κυτταρικό επίπεδο του βιολογικού κύκλου του παρασίτου μέσα στο κουνούπι, τις αλληλεπιδράσεις με αυτό και την χρήση της πληροφορίας αυτής για την κατασκευή φορέων που δεν μεταδίδουν ελονοσία. Σκοπός και της παρούσας μελέτης είναι: Α) Η περαιτέρω ανάλυση των αλληλεπιδράσεων των πρωτεϊνών CTRP και SOAP, του παρασίτου της ελονοσίας με την υπομονάδα γ1 της λαμινίνης, in vitro, με τη μέθοδο της κατακρήμνισης συγγένειας GST. Αρχικά, οι παρασιτικές πρωτεΐνες εκφράζονται σε βακτηριακές καλλιέργειας, σε σύντηξη με την GST και στη συνέχεια απομονώνονται σε μη αποδιατακτικές συνθήκες. Οι απομονωμένες πρωτεΐνες αφήνονται να αλληλεπιδράσουν με την λαμινίνη, σε κατάλληλες συνθήκες. Η αλληλεπίδραση ανιχνεύεται με ανοσοανίχνευση με western blot. Τα πειράματα κατακρήμνισης συγγένειας GST δείχνουν την ισχυρή αλληλεπίδραση μεταξύ των πρωτεϊνών CTRP και SOAP του παρασίτου και της λαμινίνης του κουνουπιού. Β) Επίσης, γίνονται πειράματα ανοσοεντοπισμού της λαμινίνης σε μεσέντερα κουνουπιών μολυσμένα με παράσιτα, στα οποία έχει γίνει λειτουργική απενεργοποίηση (knock out) των πρωτεϊνών p28, SOAP, p25, καθώς και σύγκριση με παράσιτα αγρίου τύπου. Σε μονιμοποιημένα μεσέντερα γίνεται χρώση για την λαμινίνη και για παρασιτικές πρωτεΐνες και στη συνέχεια ακολουθεί παρατήρηση με συνεστιακή μικροσκοπία. Τα πειράματα αυτά έδειξαν ίδια τοπολογική κατανομή της λαμινίνης σε σχέση με τον ωοκινέτη σε μεσέντερα μολυσμένα με ωοκινέτες αγρίου τύπου και με λειτουργική απενεργοποίηση του γονιδίου SOAP.
(EL)
Malaria is still one the biggest burdens of world health. It causes one million deaths and it is estimated that 300 million people are affected annually. Anopheline mosquitoes transmit the Plasmodium parasites, which cause the disease. The area affected by malaria the most is sub-Saharan Africa, where 90% of the annual cases occur. It is believed that in the future annual malaria cases will increase in sub-Saharan Africa and occurrence will expand in other parts of Africa and Europe, since traditional control methods are currently inadequate. Therefore, scientists are now turning towards new, alternative, methods of control. The life cycle of the parasite includes a number of different stages, among these, the ookinete stage. The ookinete is a motile form that invades the midgut epithelium and subsequently reaches the basal lamina. After contacting the basal lamina the ookinete stops transforms into an oocyst. During the ookinete stage the parasites undergo severe loses, which make it an ideal candidate for the application of new control methods. As a result, many studies focus on understanding of mosquitoparasite interactions, during the vector stage of the parasite cycle, at a cellular and molecular level, to ultimately use this information to produce genetically modified refractory mosquitoes. The aim of this study is: Α) Further study of the interactions between two parasitic proteins CTRP and SOAP, and the laminin γ1 subunit, in vitro, with GST pull downs. For this purpose, CTRP and SOAP are fused to a GST tag and expressed in bacterial cultures and then purified under native conditions. Next, an interaction takes place between the purified proteins and laminin, under the correct conditions. Interactions are recognized with western blot analysis. These GST pull down experiments show a strong interaction between CTRP, SOAP and mosquito laminin. Β) Observation, with confocal microscopy, of fixed midguts stained for laminin and infected with parasites, knock out for p28, SOAP, p25, and comparison with midgets infected with wild type parasites. These experiments show co-staining between the wild type parasites and laminin. The same pattern is observed for SOAP knock out parasites.
(EN)
