In vitro και in vivo μελέτες της πρόσδεσης των πρωτεϊνών bHLH E(SPL) σε στόχους DNA

RDF 

 
Το τεκμήριο παρέχεται από τον φορέα :
Πανεπιστήμιο Κρήτης
Αποθετήριο :
E-Locus Ιδρυματικό Καταθετήριο
δείτε την πρωτότυπη σελίδα τεκμηρίου
στον ιστότοπο του αποθετηρίου του φορέα για περισσότερες πληροφορίες και για να δείτε όλα τα ψηφιακά αρχεία του τεκμηρίου*
κοινοποιήστε το τεκμήριο



Σημασιολογικός εμπλουτισμός/ομογενοποίηση από το EKT
2007 (EL)
In vitro και in vivo μελέτες της πρόσδεσης των πρωτεϊνών bHLH E(SPL) σε στόχους DNA

Koubanakis, Constantinos A
Κουμπανάκης, Κωνσταντίνος Α

Δελιδάκης, Χρήστος

Οι πρωτεΐνες τύπου basic helix-loop-helix (bHLH) παίζουν αποφασιστικό ρόλο σε πολλές αναπτυξιακές διαδικασίες σε όλους τους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, μεταξύ των οποίων περιλαμβάνεται και ο καθορισμός των νευρικών κυττάρων κατά την ανάπτυξη του Κεντρικού και Περιφερικού Νευρικού Συστήματος (ΚΝΣ και ΠΝΣ αντίστοιχα) των μεταζώων. Στη δροσόφιλα, τα πρώτα στάδια της νευρογένεσης χαρακτηρίζονται από την έκφραση των πρωτεϊνών bHLH της υποοικογένειας AS-C (Achaete-Scute Complex), η οποία περιλαμβάνει μεταγραφικούς ενεργοποιητές που έχουν την ικανότητα να ετεροδιμερίζονται με την απανταχού εκφραζόμενη πρωτεΐνη Daughterless (Da), επίσης τύπου bHLH, και να ενεργοποιούν τη μεταγραφή γονιδίων-στόχων, προσδενόμενες σε ειδικές αλληλουχίες, τα λεγόμενα στοιχεία ΕΑ. Η έκφραση των AS-C παρατηρείται αρχικά σε ομάδες κυττάρων, που καλούνται προνευρικοί συναθροισμοί. Σε μεταγενέστερα στάδια όμως η έκφρασή τους περιορίζεται σε ένα ή λίγα κύτταρα από κάθε συναθροισμό, τα οποία και διαφοροποιούνται τελικά σε νευροβλάστες. Ο περιορισμός της έκφρασης των AS-C οφείλεται στη δράση μιας ανταγωνιστικής ομάδας πρωτεϊνών bHLH, οι οποίες κωδικοποιούνται από το γονιδιακό σύμπλοκο Enhancer Of split [E(spl)-C], το οποίο περιλαμβάνει μεταγραφικούς καταστολείς τύπου bHLH, που έχουν την ικανότητα να προσδένονται ως ομοδιμερή σε ειδικές αλληλουχίες, όπως τα στοιχεία EB, EC και Ν. Οι πρωτεΐνες bHLH E(spl) ενεργοποιούνται άμεσα μεταγραφικά από το σηματοδοτικό μονοπάτι του Notch (N) και η έκφρασή τους έχει ως αποτέλεσμα την καταστολή της νευρικής τύχης στα κύτταρα των προνευρικών συναθροισμών που δέχονται το σήμα του Ν, τόσο στο ΚΝΣ όσο και στο ΠΝΣ της μύγας. Η ανταγωνιστική δράση των δύο ομάδων πρωτεϊνών έχει δειχθεί ότι βασίζεται σε διαπρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις, με τις E(spl) να στρατολογούνται στις ρυθμιστικές περιοχές τόσο των ίδιων των γονιδίων AS-C (τα οποία υπόκεινται σε θετική αυτορύθμιση), όσο και πιθανότατα άλλων νευροειδικών γονιδίων, που αποτελούν κοινούς στόχους των δύο ομάδων πρωτεϊνών, μέσω αλληλεπίδρασης με τα σύμπλοκα των ενεργοποιητών Da/AS-C, τα οποία και προσδένονται άμεσα στο DNA, χωρίς να απαιτείται έτσι άμεση πρόσδεση εκ μέρους των E(spl). Εντούτοις, η επιβεβαιωμένη ικανότητα των E(spl) να προσδένονται άμεσα στο DNA και η παρουσία συντηρημένων θέσεων πρόσδεσης για τις E(spl) στις ρυθμιστικές περιοχές γονιδίων-στόχων, μας ώθησαν να διερευνήσουμε καταρχάς σε μεγαλύτερο βάθος τις τυχόν ειδικές προτιμήσεις πρόσδεσης καθεμιάς από τις επτά bHLH πρωτεΐνες του συμπλόκου E(spl), αλλά και των ετεροδιμερών που είχαν δειχθεί παλαιότερα ότι μπορούν να σχηματίζουν. Κατά δεύτερον, εξετάσαμε αν συγκεκριμένες αλληλουχίες πρόσδεσης μπορούν να επηρεάσουν τη στρατολόγηση και τη συνακόλουθη καταστολή από τις E(spl) σε φυσικούς ενισχυτές στη μύγα. Τέλος, επιχειρήσαμε να διαλευκάνουμε το ρόλο που παίζει η άμεση πρόσδεση στο DNA, σε σχέση με την έμμεση στρατολόγηση από τα σύμπλοκα των ενεργοποιητών, για τη μεταγραφική καταστολή από τις E(spl), χρησιμοποιώντας για το σκοπό αυτό κατάλληλους, τεχνητούς ενισχυτές. Επιβεβαιώσαμε έτσι αρχικά ότι οι επτά πρωτεΐνες bHLH E(spl) προσδένονται γενικά πολύ ισχυρότερα σε αλληλουχίες τύπου ΕΒ, που ήταν γνωστό ότι αποτελούν τις καλύτερες δυνατές θέσεις πρόσδεσης, σε σχέση με αλληλουχίες τύπου ΕC. Δείξαμε όμως επιπλέον ότι οι επτά πρωτεΐνες εμφανίζουν διακριτή συνάφεια πρόσδεσης, κάποιες δηλαδή προσδένονται ισχυρότερα από άλλες ως ομοδιμερή. Δείξαμε επίσης ότι συγκεκριμένα ετεροδιμερή μπορεί να έχουν ενισχυμένη ή μειωμένη συνάφεια πρόσδεσης σε σχέση με τα αντίστοιχα ομοδιμερή και υπολογίσαμε το συντελεστή διάστασης (Kd) για κάποια από τα σύμπλοκα. Η επιδραση του διμερισμού στην πρόσδεση των E(spl) φάνηκε να βασίζεται τόσο στην περιοχή HLH, όσο και στην περιοχή Orange (O), χαρακτηριστικά επίσης συντηρημένη μεταξύ των μελών της οικογένειας, γεγονός που υποδηλώνει ότι η περιοχή αυτή θα πρέπει να διαμεσολαβεί στην αλληλεπίδραση μεταξύ των πρωτεϊνών. Τα αποτελέσματα in vitro υπέδειξαν ότι τα σύμπλοκα μεταξύ των E(spl) μπορούν να προσδένονται στις ίδιες θέσεις, διαφέρει όμως η ισχύς της πρόσδεσης. Στο in vivo σύστημα, επιβεβαιώθηκε ότι η ικανότητα καταστολής εκ μέρους των E(spl) βασίζεται στη διαφορετική ικανότητα πρόσδεσής τους στα διάφορα στοιχεία τύπου ΕΒ και ΕC. Φάνηκε όμως επίσης ότι οι εκατέρωθεν του στοιχείου EB/C τρινουκλεοτιδικές αλληλουχίες, που είχαν δειχθεί παλαιότερα ότι είναι σημαντικές για την πρόσδεση των E(spl), μπορούν να επηρεάζουν αποφασιστικά την πρόσβασή τους στο DNA. Η άμεση πρόσδεση στο DNA φάνηκε τέλος να λειτουργεί σε συνδυασμό με την έμμεση στρατολόγηση από τους προσδεδεμένους στο DNA ενεργοποιητές, καθώς η μεταγραφική καταστολή από τις E(spl) ενισχύεται όταν εμπλέκονται και οι δύο μηχανισμοί. Μάλιστα, η φυσική αλληλεπίδραση των E(spl) με τις Da/AS-C έδειξε να σταθεροποιεί την καθήλωση των πρωτεϊνών στο DNA. Τα παραπάνω αποτελέσματα μπορούν να υποστηρίξουν ένα μοντέλο δράσης των E(spl), όπου η ικανότητά τους να επιφέρουν μεταγραφική καταστολή βασίζεται καταρχάς στη διαφορική ικανότητά τους να συγκροτούν ομο- και ετεροδιμερή με διακριτές ικανότητες πρόσδεσης στο DNA, αλλά και διακριτές ικανότητες αλληλεπίδρασης με τους ενεργοποιητές Da/AS-C, όπως ήταν ήδη γνωστό. Η πρόσβασή τους στις ρυθμιστικές περιοχές γονιδίων-στόχων φαίνεται να εξαρτάται τόσο από την άμεση πρόσδεση στο DNA, όσο και από την ικανότητά τους να αλληλεπιδρούν με τους ενεργοποιητές, με τρόπο που εξαρτάται τόσο από τις συγκεκριμένες πρωτεΐνες που εμπλέκονται κάθε φορά, όσο και από το είδος και τη σχετική θέση των ειδικών θέσεων πρόσδεσης για κάθε σύμπλοκο. Οι δύο μηχανισμοί μπορούν να συμβάλλουν σε μια σαφή, ακριβή μεταγραφική απόκριση, σε συνθήκες όπου χρειάζεται να ενσωματωθούν μηνύματα από διαφορετικά σηματοδοτικά μονοπάτια και η σχετική ποσότητα (και πιθανόν ενεργότητα) των ρυθμιστικών πρωτεϊνών που εμπλέκονται υπόκεινται σε συνεχείς, μικρές ή μεγάλες, διακυμάνσεις. (EL)
The basic helix-loop-helix (bHLH) family of proteins plays important roles in many developmental processes in eukaryotes, including the determination of the Central and Peripheral Nervous System (CNS and PNS, respectively) in metazoa. Early neurogenesis in Drosophila is characterized by the expression of the genes of the Achaete-Scute Complex (AS-C), which encode bHLH transcriptional activators that can heterodimerize with the ubiquitous bHLH protein daughterless (Da), and activate transcription of target genes by direct binding onto specific DNA sequences, the so called EA boxes. Expression of AS-C is initially observed in groups of cells called proneural clusters. In later stages however, AS-C expression is limited to one or few cells in each cluster, which will differentiate to become neuroblasts. The factors responsible for the limitation of AS-C expression are encoded by the Enhancer of split complex [E(spl)-C], which contains, among others, bHLH transcriptional repressors, that have the ability to bind as homodimers to specific DNA sequences, such as the EB, EC and N boxes. The bHLH E(spl) genes are transcriptionally activated by the Notch (N) signaling pathway and they act to repress neural fate in the cells of the proneural clusters that receive the N signal both in the CNS and the PNS of the fly. The antagonistic action of the two groups of proteins has been shown to be based on direct physical interactions, so that the E(spl) proteins are recruited on their targets via physical association with the activator complexes which are bound on DNA, without the need of direct DNA binding by E(spl) themselves. Their targets include the AS-C genes (which are positively autoregulated), and possibly other neuron-specific genes that are common targets for both groups. Nevertheless, the confirmed ability of E(spl) to bind DNA and the presence of conserved binding sites in the regulatory regions of their target genes prompted us to look more carefully at the binding preferences of E(spl) homodimers and heterodimers. Then, we asked whether particular binding sites on natural enhancers can affect recruitment on DNA and transcriptional repression conferred by E(spl). Finally, using appropriate artificial enhancers we tried to define the actual role of direct DNA binding versus recruitment by activators for transcriptional repression by E(spl). Initially, we confirmed that the optimal binding site for E(spl) is the EB and not the EC box. However, we noticed that the seven proteins do not share the same affinity for DNA binding, that is some homodimers bind better than others on the same sites. We also showed that particular heterodimers can have altered DNA binding affinity with respect to homodimers and calculated the dissociation constant for some of the complexes. The dimerization among the seven proteins, which is an important prerequisite for DNA binding, seemed to depend both on the HLH domain and the Orange domain, which is also conserved in the family. The in vivo results also showed that the seven proteins can bind on the same EB and EC sites, albeit not with the same strength. Moreover, we demonstrated that the trinuclotide sequences surrounding the core EB/C site, previously shown to be important for binding, can dramatically affect their access onto DNA. Finally, we showed that direct DNA binding by E(spl) can work in cooperation with recruitment by activators, as transcriptional repression by E(spl) is enhanced when both mechanisms are employed. In fact, physical interactions between E(spl) and Da/AS-C seemed to stabilize their binding on DNA. The above results support a model, where transcriptional repression by E(spl) depends on their differential ability to homo- and heterodimerize, but also on particular preferences for interaction with both DNA and Da/AS-C activators. Access to regulatory elements of target genes is achieved by both direct DNA binding and recruitment by activators, depending on the particular members of the two groups of proteins expressed but also on the presence and relative positions of binding sites for both complexes. The two mechanisms can contribute to a sharp, accurate transcriptional response, under conditions where the amount and, perhaps, the activity of the regulatory proteins involved continiously fluctuates, as a result of integration of signals from multiple signaling pathways. (EN)

text

Πανεπιστήμιο Κρήτης (EL)
University of Crete (EN)

2007-06-27




*Η εύρυθμη και αδιάλειπτη λειτουργία των διαδικτυακών διευθύνσεων των συλλογών (ψηφιακό αρχείο, καρτέλα τεκμηρίου στο αποθετήριο) είναι αποκλειστική ευθύνη των αντίστοιχων Φορέων περιεχομένου.