Ο καρκίνος του προστάτου αποτελεί τη δεύτερη πιο συχνή αιτία θανάτου από καρκίνο, στον άντρα. Η συχνότητα εμφάνισης και η θνησιμότητα από καρκίνο του προστάτου αυξάνονται ραγδαία προϊούσης της ηλικίας. Υπάρχουν πολλοί παράγοντες τόσο γενετικοί όσο και περιβαλλοντικοί που εμπλέκονται στην ανάπτυξή του χωρίς όμως ο ρόλος τους να είναι ξεκάθαρος. Επιπλέον, στον προστατικό αδένα παρόλο που η ύπαρξη καρκινικών εστιών είναι πάρα πολύ συχνή, ένας μικρός μόνο αριθμός θα οδηγήσει στη δημιουργία όγκου. Πιθανολογείται ότι αυτό οφείλεται σε διάφορους παράγοντες που δρούν τοπικά και προάγουν ή αναστέλλουν τη δημιουργία του. Πιθανό παράγοντα αποτελούν τα νευροπετίδια γενικότερα και ειδικότερα τα οπιοειδή τα οποία θα μπορούσαν να ανευρίσκονται στον προστατικό αδένα είτε μετά από παραγωγή τους τοπικά, είτε μέσω της κυκλοφορίας (πχ β-ενδορφίνη ή τροφικής προέλευσης πεπτίδια). Τα αποτελέσματα της παρούσης διατριβής παρέχουν στοιχεία για το πιθανό ρόλο των οπιοειδών στον καρκίνο του προστάτου. Πιο συγκεκριμένα βρέθηκε ότι τα οπιοειδή, αλκαλοειδή, πεπτίδια αλλά και καζομορφίνες παρουσιάζουν δράση σε καρκινικά κύτταρα προστάτου (DU-145, PC3 και LNCaP) ελαττώνοντας τον ρυθμό πολλαπλασιασμού τους. Η δράση τους αυτή στις κυτταρικές DU-145 και PC3 στις περισσότερες περιπτώσεις ήταν αναστρέψιμη παρουσία του γενικού οπιοειδούς ανταγωνιστή διπρενορφίνη, γεγονός που υποδεικνύει δράση μέσω ειδικών θέσεων δέσμευσης. Πράγματι, ανιχνεύθηκαν οπιοειδείς υποδοχείς και στις δύο κυτταρικές σειρές. Στη κυτταρική σειρά DU-145 ανιχνεύθηκαν οι μι, κ1 και κ3 υπότυποι των οπιοειδών υποδοχέων στους οποίους δεσμεύονται με υψηλή συγγένεια, ενώ στην κυτταρική σειρά PC3 οι μι και κ1 υπότυποι. Αντίθετα, στην κυτταρική σειρά LNCaP όπου η διπρενορφίνη δεν ανέστρεφε τη δράση των οπιοειδών και σε κάποιες περιπτώσεις την ενίσχυε δεν ανιχνεύθηκαν οπιοειδείς υποδοχείς. Η ανασταλτική δράση των καζομορφινών ήταν λιγότερο έντονη από αυτή των αλκαλοειδών και των άλλων πεπτιδίων που μελετήθηκαν. Με δεδομένο ότι κάθε κυτταρική σειρά επιλέγχθηκε με βάση την ανταπόκρισή της στα ανδρογόνα έτσι ώστε να αντιπροσωπεύει διαφορετικά στάδια της νόσου παρατηρούμε ότι η εμφάνιση των οπιοειδών υποδοχέων θα μπορούσε να σχετίζεται με την εξέλιξη της νόσου σε ορμονοαντοχή. Η δράση όμως των οπιοειδών στα καρκινικά κύτταρα του προστάτου δεν πραγματοποιείται αποκλειστικά μέσω των οπιοειδών υποδοχέων. Στο συμπέρασμα αυτό καταλήγουμε γιατί στα κύτταρα DU-145 και PC3 η δράση τους δεν είναι πλήρως αναστρέψιμη από τη διπρενορφίνη και φυσικά γιατί στα κύτταρα LNCaP δεν ανιχνεύθηκαν οπιοειδείς υποδοχείς. Ελέχθηκε έτσι η πιθανότητα η δράση τους να πραγματοποιείται πρώτον μέσω άλλων μεμβρανικών συστημάτων υποδοχέων και δεύτερον να δρούν αλληλεπιδρώντας με άλλα συστήματα. Ανιχνεύθηκε μικρός αριθμός υποδοχέων σωματοστατίνης στα κύτταρα DU-145 και PC3, στους οποίους όμως τα οπιοειδή δεν δεσμεύονται, σε αντίθεση με τον καρκίνο του μαστού, ενώ δεν ανιχνεύθηκαν στα κύτταρα LNCaP. Στη κυτταρική σειρά LNCaP ανιχνεύθηκαν όμως α1 αδρενεργικοί υποδοχείς στους οποίους δεσμεύεται η EKC και μικρό μέρος της δράσης της διαμεσολαβείται μέσω των α1 αδρενεργικών υποδοχέων. Επιπλέον, στα κύτταρα LNCaP παρατηρήθηκε ταχεία μη γενωμική δράση των ανδρογόνων η οποία έχει ως αποτέλεσμα αύξηση της έκκρισης του PSA και η οποία πραγματοποιείται μέσω ειδικών θέσεων δέσμευσης των ανδρογόνων οι οποίες ανιχνεύθηκαν στη μεμβράνη των κυττάρων. Αποτέλεσμα της δέσμευσης της τεστοστερόνης στους μεμβρανικούς υποδοχείς είναι η αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης στην οποία οφείλεται και η αύξηση στην έκκριση του PSA. Όσον αφορά τα οπιοειδή βρέθηκε ότι η EKC αναστέλλει την επαγώμενη από τα ανδρογόνα έκκριση του PSA τόσο σε σύντομα χρονικά διαστήματα πιθανώς αλληλεπιδρώντας με τον κυτταροσκελετό της ακτίνης, όσο και σε μεγάλα χρονικά διαστήματα πιθανώς ελαττώνοντας τον αριθμό των μεμβρανικών ανδρογονικών υποδοχέων. Τέλος, βρέθηκε ότι διαφορετικό τρόπο δράσης των οπιοειδών πιθανώς να αποτελεί και το σύστημα της ελεύθερης ρίζας του μονοξειδίου του αζώτου. Πράγματι, καρκινικά κύτταρα μαστού βρέθηκε ότι παράγουν ΝΟ και ότι τα οπιοειδή ανέστειλαν την παραγωγή της αλληλεπιδρώνας απευθείας με το ένζυμο υπεύθυνο για τη σύνθεση της (ΝΟS). Οι καρκινικές κυτταρικές σειρές του προστάτου βρέθηκε επίσης ότι παράγουν ΝΟ τα οπιοειδή όμως δεν επηρρεάζουν άμεσα τη δραστικότητα της NOS υποδηλώνοντας έναν διαφορετικό μηχανισμό. Παράλληλα με τα διάφορα οπιοειδή, των οποίων η δράση μελετήθηκε ταυτοποιήθηκαν και δύο νέα πεπτίδια: α) η αs1 καζομορφίνη, η οποία προέρχεται από την αλληλουχία της αs καζείνης του ανθρωπίνου γάλακτος και θα μπορούσε να απελευθερωθεί με τη δράση των πρωτεολυτικών ενζύμων. Παρουσιάζει ισχυρή οπιοειδή δράση αναστέλλοντας τον πολλαπλασιασμό των τριών καρκινικών κυτταρικών σειρών του προστάτου καθώς και καρκινικών κυττάρων μαστού. Η δράση της πραγματοποιείται κυρίως μέσω των κάππα οπιοειδών υποδοχέων στους οποίους δεσμεύεται με υψηλή συγγένεια αλλά και τους μι. Αντικατάσταση του καρβοξυλικού της άκρου με αμινομάδα είχε ως αποτέλεσμα ελάττωση της δράσης της. β) Η ρεσεπτορφίνη η οποία παρουσιάζει ισχυρή ανασταλτική δράση μέσω των οπιοειδών υποδοχέων. Η ιδιαίτερη σημασία της έγκειται στο γεγονός ότι η αλληλουχία της απαντάται στο δεύτερο κοινό διαμεμβρανικό τμήμα των οπιοειδών υποδοχέων σε μια σειρά από διαφορετικά είδη οργανισμών. Πιθανή απελευθέρωση της μετά από κυτταρικό θάνατο θα μπορούσε να επάγει ένα σύστημα θετικής παλίνδρομης ρύθμισης στη δράση παραγόντων που οδηγούν σε κυτταρικό θάνατο. Συνοψίζοντας, με τα δεδομένα της παρούσης διατριβής παρουσιάζονται στοιχεία για τον πιθανό ρόλο των οπιοειδών στην αύξηση των καρκινικών προστατικών κυττάρων καθώς και στοιχεία για μία πιθανή νέα, ίσως πιο φυσιολογική, προσέγγιση στη φαρμακευτική αγωγή του καρκίνου του προστάτου.
(EL)
Prostate cancer is second, only to lung cancer, most common cause of death from cancer in men. The incidence of prostate cancer increases rapidly with age. A large number of different factors (genetic and environmental) are involved in initiation and progression of prostate cancer but their role remains uncertain. In addition, the presence of foci of cancer within the prostate gland is much more common than the clinically diagnosed disease. Possibly a number of different factors interact locally within the prostate gland and promote or inhibit tumor growth, including neuropeptides and specifically opioids which can reach prostate either through the general circulation (β-endorphine and food derived peptides) or being locally produced by neuroendocrine cells present in the prostate gland. The results of the present study provide evidences for a possible involvement of opioids in the prostate cancer. It was found that opioids, alkaloids, peptides and casomorphines, inhibit cell growth of three human prostate cancer cell lines (DU-145, PC3 and LNCaP). Their inhibitory action on DU-145 and PC3 cells can be reversed by the general opioid antagonist, diprenorphine, an action indicateng a mediation through specific opioid binding sites. Indeed, opioid receptors were identified in both cell lines: DU-145 cells bear mu, kappa 1 and kappa 3 opioid receptors while in PC3 cells mu and kappa 1 sites were identified. On the contrary, LNCaP cells where the action of opioids was not reversed bur rather enhanced by the opioid antagonist diprenorphine, no opioids receptors were identified. The inhibitory action of casomorphins tested was lower than the action of alkaloids and peptides studied, while the same participation of opioid receptors was identified. The three different prostate cancer cell lines used in our study were selected in order to have different degree of differentiation and represent different stages of prostate cancer. From our results it seems that opioids receptors are present in more advanced, hormone independent, stages of prostate cancer. The fact that opioid action in DU-145 and PC3 cells is not completely reversed by diprenorphine, in combination with the absence of opioid receptors in LNCaP cells indicate that their action might not be mediated only through opioid receptors. Therefore, we first tested the possibility for their action to be mediated via other membrane receptor systems, presenting an homology with opioid receptors and secondly by interacting with other systems. A small number of somatostatin receptors were identified only in DU-145 and PC3 cells but opioids did not bind to them. In LNCaP cells, α1 adrenergic receptors were identified. EKC binds to α1 adrenergic receptors and part of its inhibitory action is mediated through them. Moreover, in the hormone dependent LNCaP cells a rapid non genomic action of androgens was observed inducing PSA secretion. This action was mediated via specific membrane binding sites identified in LNCaP cells. The rapid action of testosterone through membrane binding sites results in reorganization of actin cytoskeleton which is responsible for the increase in PSA secretion. Opioids, specifically EKC, inhibit the rapid androgen induced, PSA secretion, probably by interacting with actin cytoskeleton, while long term androgen action is inhibited by opioids probably by reducing the number of androgen membrane binding sites. Finally, it was found that an alternative way of opioid action could be the system of nitric oxide. Indeed, breast cancer cells produce nitric oxide and opioids inhibit its production by directly interacting with nitric oxide synthase (NOS). Prostate cancer cell lines also produce NO but opioids do not directly affect NOS activity indicating a different mechanism of action. In parallel, studying the action of different opioids, two new opioid peptides were identified: a) αs1 casomorphine which was derived from the sequence of human αs casein and could be released by the action of proteolytic enzymes. It shows a very potent antiproliferative action in prostate and breast cancer cells. Its action is mediated mainly through kappa opioid receptors, binding to them with high affinity and mu opioid receptors. Replacing the carboxylic end of αs1 casomorphine with an amino group resulted in a lower action. b) Receptorphin which also strongly inhibits cell growth via opioid receptors. The significance of this peptide, relies on the fact that its sequence is found on the second transmembrane region of opioid receptors in different species. Possible release of receptorphin after cell death could induce a positive feedback in the action of different factors that cause cell death. In conclusion, the results of the present study supply evidences for a possible role of opioids in the growth of prostate cancer cells, as well as, a new, more physiologic, approach to the treatment of prostate cancer.
(EN)
