Το zebrafish είναι ένα μικρό, πολύχρωμο, τροπικό ψάρι που αποικίζει μικρές λίμνες και ρυάκια της Νοτιοανατολικής Ασίας. Τις τελευταίες δεκαετίες αποτελεί έναν πολύ σημαντικό οργανισμό-μοντέλο σε διάφορα πεδία έρευνας όπως η Νευροβιολογία, η Αναπτυξιακή Βιολογία και η Γενετική. Παρόλα αυτά, τα υπάρχοντα δεδομένα βιολογίας και οικολογίας του είδους είναι εξαιρετικά ελλιπή, με συνέπεια να υπάρχει ένα αρκετά μεγάλο κενό γνώσης όσον αφορά στις προτιμήσεις του απέναντι στις περιβαλλοντικές συνθήκες και ιδίως ως προς τη θερμοκρασία που αποτελεί την πιο καθοριστική. Το αντικείμενο λοιπόν της παρούσας εργασίας είναι να μελετηθεί η επίδραση διαφορετικών θερμοκρασιών ανάπτυξης στη μορφολογία και τη λειτουργία του μικρού αυτού οργανισμού.
Για να γίνει αυτό, χρησιμοποιήθηκαν αυγά από γεννήτορες άγριου τύπου του εργαστηρίου Υδατοκαλλιεργειών (Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Κρήτης), τα οποία τοποθετήθηκαν μετά την ωοτοκία σε τέσσερα διαφορετικά ενυδρεία με θερμοκρασίες 22, 25, 28 και 31 οC. Όλες οι συνθήκες –πέραν της θερμοκρασίας- παρέμειναν οι ίδιες και σταθερές μεταξύ των τεσσάρων ενυδρείων. Τα αυγά εκκολάφθηκαν και οι νύμφες μεγάλωσαν στα ενυδρεία αυτά μέχρι περίπου και τη μεταμόρφωση οπότε και έγιναν οι δειγματοληψίες για τη διενέργεια των μελετών. Οι εκτροφές έγιναν σε 2 επαναλήψεις ενώ όλη η διαδικασία πραγματοποιήθηκε 3 φορές για την κάλυψη των αναγκών σε δείγματα. Οι χαρακτήρες που επιλέχθηκαν να μελετηθούν ήταν οι παραμορφώσεις, το σχήμα του σώματος, τα μεριστικά στοιχεία, το φύλο, η ικανότητα κολύμβησης και ο μεταβολισμός του γαλακτικού οξέος στους μύες του ψαριού.
Για τη μελέτη των παραμορφώσεων εξετάσθηκαν η σπονδυλική στήλη και το ραχιαίο, εδρικό και ουραίο πτερύγιο σε άτομα μήκους 13,78 ± 2,9 mm TL. Τα άτομα που επιλέχθηκαν (50 ανά επανάληψη ανά θερμοκρασιακή συνθήκη) υποβλήθηκαν σε διπλή χρώση αλιζαρίνης-κυανού της αλσατίας και εξετάσθηκαν σε στερεοσκόπιο. Η μελέτη τους έδειξε ότι δεν υπήρξε σαφής επίδραση της θερμοκρασίας καθώς σε όλες τις θερμοκρασιακές συνθήκες που εξετάστηκαν, παρουσιάστηκαν υψηλά ποσοστά παραμορφώσεων στο σύνολο σχεδόν των εξετασθέντων ατόμων (100% εμφάνιση παραμορφωμένων ατόμων σε όλες τις θερμοκρασίες πλην των 25 οC όπου τα παραμορφωμένα αποτέλεσαν το 99% του πληθυσμού). Από την άλλη πλευρά, η πολυπαραγοντική ανάλυση έδειξε ότι το είδος των παραμορφώσεων που εμφανίζεται σε κάθε άτομο επηρεάζεται σημαντικά από τη θερμοκρασία ανάπτυξης και ότι τα διαφορετικά αυτά είδη κατηγοριοποιήθηκαν σε δύο μεγάλες ομάδες: τις παραμορφώσεις της σπονδυλικής στήλης και τις παραμορφώσεις των πτερυγίων.
Για τη μελέτη του σχήματος του σώματος τοποθετήθηκαν 17 γεωμετρικά ορόσημα (landmarks) σε ψηφιακές φωτογραφίες 50 ατόμων ανά θερμοκρασιακή συνθήκη μήκους 13,5± 1,9 mm TL. . Από τα σημεία αυτά οριοθετήθηκαν 28 αποστάσεις (μορφομετρικοί χαρακτήρες) στο σώμα των ατόμων οι οποίες απετέλεσαν τη βάση της πολυπαραγοντικής ανάλυσης του σχήματος του σώματος. Η ανάλυση αυτή έδειξε ότι η θερμοκρασία ανάπτυξης επιδρά σημαντικά στο σχήμα του σώματος των zebrafish και ότι οι χαρακτήρες που συνεισφέρουν περισσότερο στη διαφοροποίηση των ομάδων εντοπίζονται στο οπίσθιο μέρος του σώματος.
Τα μεριστικά στοχεία μελετήθηκαν στα ίδια άτομα τα οποία χρησιμοποιήθηκαν και για την ανάλυση του σχήματος του σώματος. Τα άτομα αυτά υποβλήθηκαν σε διπλή χρώση αλιζαρίνης-κυανού της αλσατίας και εξετάσθηκαν (σε στερεοσκόπιο) η σπονδυλική στήλη, το ραχιαίο, το εδρικό, το ουραίο, τα θωρακικά και τα κοιλιακά πτερύγια. Όπως αποδείχθηκε, η θερμοκρασία που επικρατεί κατά την οντογένεση του zebrafish έχει έντονη επίδραση στον τελικό αριθμό των μεριστικών του στοιχείων καθώς στις περισσότερες περιπτώσεις παρατηρήθηκε διαφοροποίηση του αριθμού τους στις ακραίες θερμοκρασίες (22 και/ή 31 οC) σε σχέση με τις υπόλοιπες. Ειδικότερα, ο αριθμός των σπονδύλων και των ακτινών του ραχιαίου πτερυγίου ήταν μεγαλύτερος στους πληθυσμούς των 22 οC, ενώ ο αριθμός των ακτίνων των θωρακικών και κοιλιακών πτερυγίων ήταν μικρότερος στους πληθυσμούς των 31 οC. Στις ακτίνες του εδρικού πτερυγίου η διαφοροποίηση εντοπίσθηκε μεταξύ των χαμηλών (22 και 25 οC) και των υψηλών (28 και 31 οC) θερμοκρασιών ενώ στις ακτίνες του ουραίου πτερυγίου (λεπιδοτρίχια και δερματοτρίχια) δεν παρατηρήθηκε κάποια συγκεκριμένη τάση.
Η εκτροφή των δειγμάτων για την ανάλυση του φύλου ολοκληρώθηκε 94-107 ημέρες μετά την εκκόλαψη με την τυχαία δειγματοληψία και τη συντήρηση 25 ατόμων από κάθε επανάληψη και θερμοκρασία. Η ιστολογία των γονάδων που πραγματοποιήθηκε στο Ινστιτούτο Υδατοκαλλιεργειών του Ελληνικού Κέντρου Θαλασσίων Ερευνών (Δρ. Μυλωνάς) αποκάλυψε ότι η θερμοκρασία ανάπτυξης επιδρά σημαντικά στην αναλογία του φύλου στους πληθυσμούς zebrafish. Συγκεκριμένα, η χαμηλή θερμοκρασία εκτροφής οδήγησε σε κυριαρχία των αρσενικών μέσα στον πληθυσμό (22 °C, 87.1 % αρσενικά), οι δύο ενδιάμεσες (25 και 28 οC) σε αναλογία φύλου 1:1 και η υψηλότερη θερμοκρασία της δοκιμής σε κυριαρχία των θηλυκών (31 °C, 82.4 % θηλυκά).
Για τη μελέτη της κολύμβησης χρησιμοποιήθηκαν αρσενικά άτομα zebrafish μήκους 34,4 ± 2,17 mm TL από τις τέσσερις θερμοκρασίες ανάπτυξης τα οποία είχαν προηγουμένως εγκλιματιστεί στη θερμοκρασία των πειραμάτων (26,5 οC) για ενάμιση περίπου μήνα. Οι μετρήσεις κολύμβησης έγιναν σε ειδική συσκευή του εργαστηρίου Υδατοκαλλιεργειών και έδειξαν ότι η θερμοκρασία ανάπτυξης επιδρά σημαντικά στην κολυμβητική ικανότητα των ατόμων με τους πληθυσμούς από τους 31 οC να αποδεικνύονται οι ταχύτεροι κολυμβητές ενώ εκείνοι από τους 22 οC οι χειρότεροι. Παράλληλα, εξετάστηκε μια σειρά από μορφομετρικούς χαρακτήρες στα πειραματικά άτομα όπως το βάρος, το πάχος του σώματος, το ύψος του σώματος, το μέγιστο ύψος του σώματος και το ύψος του ουραίου μίσχου και δε βρέθηκε διαφοροποίηση μεταξύ των διαφορετικών πειραματικών ομάδων.
Για τη μελέτη του μεταβολισμού του γαλακτικού οξέος στου μύες των ψαριών, χρησιμοποιήθηκαν άτομα από την ίδια εκτροφή με τη μελέτη της κολύμβησης τα οποία υποβλήθηκαν στην ίδια διαδικασία εγκλιματισμού. Μετρήθηκε το γαλακτικό οξύ στους μύες 35 ατόμων ανά θερμοκρασία, τα οποία ήταν κατανεμημένα ανά 5 στις εξής δειγματοληπτικές περιόδους: σε κατάσταση ηρεμίας, μετά από πλήρη εξουθένωση λόγω κολύμβησης και μετά από ξεκούραση (recovery) μισής ώρας, μίας ώρας, τριών ωρών, έξι ωρών και εννιά ωρών. Η ανάλυση του γαλακτικού οξέος που πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Βιοχημείας της Ιατρικής Σχολής (Δρ. Παπακωνσταντή) αποκάλυψε ότι σε όλες τις περιπτώσεις το πρότυπο του μεταβολισμού του γαλακτικού οξέος ακολουθεί τη γνωστή οδό που έχει περιγραφεί σε άλλα είδη, αφού αυξάνει κατά τη διάρκεια της άσκησης και κατόπιν μειώνεται κατά την ξεκούραση. Σημειώθηκε επίσης ότι η θερμοκρασία ανάπτυξης δεν επηρεάζει την αρχική και τελική συγκέντρωση του γαλακτικού οξέος (σε κατάσταση ηρεμίας και σε πλήρη εξουθένωση αντίστοιχα) αλλά επηρεάζει την ταχύτητα αποδόμησής του καθώς οι πληθυσμοί των 22 οC χρειάστηκαν αρκετά μεγαλύτερο χρόνο από τους υπόλοιπους για να επανέλθουν σε κατάσταση ηρεμίας.
Από τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας γίνεται σαφές ότι το zebrafish αποτελεί έναν ιδιαιτέρως ευαίσθητο οργανισμό ως προς την επίδραση της θερμοκρασίας που επικρατεί κατά την ανάπτυξή του. Η παρατηρούμενη αυτή πλαστικότητά του στις θερμοκρασιακές αλλαγές είναι επιβεβλημένη διότι διαβιεί σε οικοσυστήματα (λίμνες και ρυάκια) με έντονες εποχιακές ή και ημερήσιες διακυμάνσεις της θερμοκρασίας τους. Η επιτυχής προσαρμογή του είδους στις αλλαγές αυτές του περιβάλλοντός εξασφαλίζουν τελικά την ασφαλή διαιώνιση του..
(EL)
Zebrafish is a small colorful tropical fish that inhabits small ponds and slow mov-ing streams in Southeast Asia. For the past few decades, it has been a very important model-organism in research fields such as Neurobiology, Developmental Biology and Genetics. Despite that, existing data on its biology and ecology remain scarce and as a result there is an important lack of knowledge concerning its preferences towards the en-vironmental conditions, especially temperature which is considered as the most crucial. The object of the current study therefore is to examine the effect of different developmen-tal temperatures on the morphology and function of this small organism.
In order to do so, eggs from a wild type broodstock kept in the Aquaculture lab (Biology Department, University of Crete) were used. After spawning, the eggs were in-troduced in four tanks of different water temperatures (22, 25, 28 and 31 °C). All other environmental conditions were kept stable and the same between the four tanks. The eggs hatched and the larvae developed in the tanks until about metamorphosis where the sam-plings took place. Duplicate experiments were conducted, whereas the whole procedure was repeated 2 more times in order to cover the demand for samples. The characters that were chosen to be studied were the deformities, the body shape, the meristics, the sex, the swimming ability and the muscle lactate metabolism.
For the deformities study, the vertebral column and the dorsal, anal and caudal fin were studied on specimens of 13,78 ± 2,9 mm TL (Total Length). Specimens (50 per du-plicate per temperature condition) were subjected to double staining of Alizarin and Al-cian Blue and were studied under a stereoscope. Their study revealed that there is not a clear effect of temperature since in almost all groups studied, the percentage of deformed specimens was the same and total (100%, with the exception of 25 οC where the percent-age of the deformed was 99%). On the other hand, multivariate analysis showed that the type of the deformity present in each specimen was affected by the developmental tem-perature and that all different types were categorized into 2 different groups: the vertebral deformities and the fin deformities (Cluster Analysis).
For the body shape analysis, 17 landmarks were placed on the digital photographs of 50 specimens from each temperature condition sized 13,5± 1,9 mm TL. Those land-marks produced 28 distances (morphometric characters) on which the multivariate analy-
sis of the body shape was conducted. The analysis showed that developmental tempera-ture significantly affects body shape and that the characters that mostly contribute to the groups’ differentiation are located at the posterior part of the fish body.
Meristic elements were studied on the same specimens as the body shape analysis. Those specimens were subjected to double staining of Alizarin and Alcian Blue and then the vertebral column, the dorsal, anal, caudal, pectoral and pelvic fins were studied under a stereoscope. As it was shown, ontogenetic temperature has an important effect on the meristic numbers since in most cases, fish developed at the extreme temperatures (22 and/or 31 οC) were clearly differentiated from the others. Specifically, meristic counts of the vertebral column and of the dorsal fin rays were significantly higher at the 22 οC populations, whereas meristic counts of the pectoral and the pelvic fins were significantly lower at the 31 οC populations. Anal fin rays presented differentiation between the low temperature (22 and 25 οC) and the high temperature groups (28 και 31 οC), while the caudal fin rays (lepidotrichia and dermatotrichia) did not present any particular trend.
Fish rearing for the sex study was terminated at 94-107 days post hatching with the random sampling and preservation of 25 specimens per duplicate per temperature. Histological observation of the gonads performed at the Institute of Aquaculture at the Hellenic Centre of Marine Research (Dr Mylonas) revealed that lower developmental temperatures induced masculinization (22 °C, 87.1 % males) whereas higher temperatures resulted in female-biased populations (31 °C, 82.4 % females). The intermediate temperatures (25 and 28 οC) leaded to 1:1 sex ratio.
For the swimming trials, only male zebrafish from the four different developmen-tal temperatures were used. They were sized 34,4 ± 2,17 mm TL and prior to the trials, were acclimatized to the swimming temperature (26,5 οC) for about one and a half month. The swimming trials were performed on a special apparatus of the Aquaculture lab and showed that developmental temperature has an important effect on the swimming ability of zebrafish, since the populations from 31 οC proved to be the fastest swimmers while the ones from 22 οC the slowest. A number of morphometric characters such as the weight, body width, body depth, maximum body depth and body depth at the caudal peduncle were examined and no differentiation was found between the different experimen-tal groups.
For the muscle lactate metabolism study, specimens as the ones of the swimming trials were used and were also subjected to the same acclimatization procedure. Muscle lactate concentration was estimated on 35 specimens per temperature which were distrib-uted at the following sampling periods: at rest, after full exhaustion due to swimming and after recovery for half hour, one hour, three hours, six hours and nine hours. Lactate analysis was performed on the Biochemistry Lab of the Medical Department (Dr Pa-paconstanti) and revealed that in all cases, lactate metabolism follows the previously es-tablished on other species pattern, since it rises during exercise and decreases during re-covery. It was also shown that developmental temperature does not affect the original and final lactate concentration (at rest and at full exhaustion respectively) but does affect its decomposition rate since the 22 οC populations require considerably more time than the others in order to fully recover.
Based on the present results, it is clear that zebrafish is a highly sensitive fish spe-cies as far as the effect of its developmental temperature is concerned. This observed plasticity on the temperature changes is a requisite since it lives in ecosystems (ponds and streams) characterized by intense seasonal and/or daily temperature fluctuations. The suc-cessful adjustment of this species to such type of environmental changes is what finally ensures its survival.
(EN)
