In vivo ανάλυση πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων του χαλκορυθμιζόμενου μεταγραφικού παράγοντα Mac1p της ζύμης

This item is provided by the institution :

Repository :
E-Locus Institutional Repository
see the original item page
in the repository's web site and access all digital files if the item*

2004 (EN)
In vivo ανάλυση πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων του χαλκορυθμιζόμενου μεταγραφικού παράγοντα Mac1p της ζύμης

Καγιαμπάκης, Ιωάννης

Η παρακάτω μελέτη επικεντρώνεται στις αλληλεπίδρασης των πρωτεϊνών Dog2p, Yol022cp, και Rad9p με των μεταγραφικο παράγοντα Mac1p. Επιπρόσθετα μελετήθηκε και ο ρόλος αυτών των αλληλεπιδράσεων. Δηκτικέ με την βοήθεια της in vivo συνανοσοκατακρήμνισης ότι οι Dog2p και Rad9p αλληλεπιδρούν με τον μεταγραφικο παράγοντα Mac1p. Αντίθετα δεν είναι βέβαιο αν η Yol022cp αλληλεπιδρά με το μεταγραφικο αυτό παράγοντα και χρειάζεται μια άλλη προσέγγιση του ερωτήματος αυτού. Αντίσωμα εναντίον της φωσφοσερίνης και πήκτωμα SDS πολυακριλαμίδης χρησιμοποιηθηκε για να διαπιστωθεί αν η Dog2p επηρεάζει τα επίπεδα φωσφορυλιωσεις του Mac1p και παράλληλα μελετήθηκε σε ποια συγκέντρωση χαλκού διασπάται ο μεταγραφικος παράγοντας Mac1p. Από τα πειράματα έγινε φανερό ότι η Mac1p δεν διασπάται σε υψηλές συγκεντρώσεις χαλκού σε αντίθεση με ότι αναφέρεται στην βιβλιογραφία. Επίσης δεν έγινε δυνατή η μελέτη της συσχέτισης της Dog2p με την φωσφορυλίωση της Mac1p, επειδή ο διαχωρισμός των δυο μορφών της Mac1p-9Myc δεν είναι τόσο καλός σε πήκτωμα SDS πολυακριλαμίδης. Μηδενικές μεταλλαγές των γονιδίων Dog1p και Dog2p δεν επηρεάζουν σημαντικά τη μεταγραφή του CTR1 τόσο σε υψηλές, όσο και σε χαμηλές συγκεντρώσεις χαλκού σε θρεπτικό YPD. Επιπρόσθετα τα μεταλλάγματα αυτά δεν φαίνεται να παρουσιάζουν καμία αλλαγή στην συγκέντρωση O2- και H2O2 μέσα στο κύτταρο σε αντίθεση με το μετάλλαγμα rad9. Στη συνέχεια μελετήθηκε σε πιο κυτταρικό διαμέρισμα βρίσκεται η πρωτεΐνη Dog2p μέσο ανοσοβιολογίας φθορισμού και ομοεστιακής μικροσκοπίας. Το αποτέλεσμα του πειράματος είναι σε συμφωνία με την βιβλιογραφία. Τέλος περιγράφεται η κλωνοποίηση του γονιδίου DOG2 στο πλασμιδιακό φορέα pYX142. Η πλασμιδιακή αυτή κατασκευή θα χρησιμοποιηθεί σε πειράματα συνανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης. (EL)
This study focuses mainly on the interaction between proteins Dog2p, Yol022cp, and Rad9p with the transcription factor Mac1p. In addition, the role of those interactions was investigated. We showed that Dog2p and Rad9p interact with Mac1p in vivo by coimmunoprecipitation assays. However, using these assays it was not clear whether the Yol022cp interacted with Mac1p, thus another approach is necessary to establish a potential interaction. SDS-PAGE and monoclonal anti-phosphoserine antibody methods were used to investigate whether Dog2p affects the phosphorylation state of Mac1p, and probe the conditions of degradation Mac1p-9Myc. The latter protein did not appear to degrade in a high-copper environment, contrary to previous reports. We were unable to establish the dependence of the phosphorylation state of Mac1p on Dog2p, because the discretion of the two forms of Mac1p was very low in an SDS-PAGE. The deletion of Dog1p and Dog2p did not significantly affect transcription of CTR1 at high or low copper environments in YPD. In addition deletion of these genes did not affect intracellular concentrations of H2O2 and O2-, as did deletion of rad9. Subcellular localization of Dog2p was investigated by immunoflorescence and confocal microscopy. Dog2p was present throughout the cell, in agreement with previous record. Finally, subcloning of DOG2 in the pYX142 vector, a construct necessary for Chromatin Immunoprecipitation (CHIP) experiments, was described. (EN)

Τύπος Εργασίας--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης



Σχολή/Τμήμα--Σχολή Θετικών και Τεχνολογικών Επιστημών--Τμήμα Βιολογίας--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης

*Institutions are responsible for keeping their URLs functional (digital file, item page in repository site)