H αφυδρογονάση της 3-φωσφορική γλυκεραλδεϋδης - Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) κατέχει σημαντικό ρόλο σε βασικές καταβολικές διαδικασίες του κυττάρου και κατά συνέπεια, δεν αποτελεί έκπληξη πως έχει παρατηρηθεί μια σχετικά σταθερή έκφρασή της στους περισσότερους ιστούς και κύτταρα, ανεξαρτήτα από εξωτερικές παραμέτρους. Συνεπώς έχει χαρακτηριστεί ως διαχειριστικό γονίδιο (housekeeping gene) και χρησιμοποιείται ως εσωτερικό γονίδιο αναφοράς σε ποσοτικές μελέτες γονιδιακής έκφρασης. Ωστόσο, στοιχεία που προέκυψαν από πρόσφατες μελέτες, δείχνουν διαφορετικά πρότυπα έκφρασης σε διάφορους οργανισμούς και ιστούς καθώς και την ύπαρξη διαφορετικών ισομορφών και ψευδογονιδίων. Επιπλέον, το GAPDH έχει αποδειχθεί ότι εμπλέκεται στις διαδικασίες της μεταγραφής, της απόπτωσης καθώς και σε άλλες λειτουργίες. Οι νέες αυτές μελέτες, καθιστούν αναγκαία την επανεκτίμηση και την περαιτέρω μελέτη των γονιδίων GAPDH, της δομής, μοριακής εξέλιξης, προτύπου έκφρασής τους και καταλληλότητά τους ως γονίδια αναφοράς. Στα πλαίσια της παρούσας μεταπτυχιακής εργασίας απομονώθηκαν και χαρακτηρίστηκαν οι δύο ισομορφές του GAPDH για την τσιπούρα (Sparus aurata) και το λαυράκι (Dicentrarchus labrax) και περιγράφεται ο τρόπος απομόνωσης και χαρακτηρισμού τους. Πραγματοποιήθηκε η φυλογενετική ανάλυσή τους με τα παράλογα γονίδια του GAPDH 10 ειδών ψαριών και με εφαρμογή μεθόδων μοριακής εξέλιξης ελέγχθηκε πιθανή δράση φυσικής επιλογής στα δύο αυτά γονίδια. Δεν παρατηρήθηκε θετική (κατευθύνουσα) επιλογή στα γονίδια. Μελετήθηκε ακόμη η δομή των ισομορφών και έγινε ανάλυση της συντενίας σε σχέση με ψάρια-«μοντέλα» που έχουν δημοσιευμένα γονιδιώματα. Εκτιμήθηκαν τα επίπεδα έκφρασης των ισομορφών του GAPDH στο λαυράκι και στη τσιπούρα σε σειρά πρώιμων αναπτυξιακών σταδίων καθώς και σε σειρά ιστών, με εφαρμογή της μέθοδου της qPCR και της One-step RT-PCR αντίστοιχα. Τα αναπτυξιακά στάδια που επιλέχθηκε να μελετηθούν στο λαυράκι περιλαμβάνουν το στάδιο του μοριδίου, το στάδιο 50% επιβολή, το στάδιο του νευριδίου, το στάδιο ¾ επιβολή, το στάδιο εκκόλαψης και το στάδιο της προνύμφης. Στην τσιπούρα περιλαμβάνονται το στάδιο του γαστριδίου, το στάδιο του ύστερου γαστριδίου, το στάδιο εκκόλαψης, το στάδιο θωρακικού πτερυγίου, το στάδιο του σχηματισμού ματιού, το στάδιο του ανοίγματος στόματος, το στάδιο του καφέ ματιού 8
καθώς και περαιτέρω σταδίων της πρώιμης ανάπτυξής : το στάδιο των μη γονιμοποιημένων αυγών, το 2,4 κυτταρικό στάδιο, το 8,16 κυτταρικό στάδιο, το 64 κυτταρικό στάδιο, το προς μορίδιο στάδιο, το προς επιβολή στάδιο, το στάδιο του βλαστιδίου (πρώϊμη επιβολή) και το στάδιο της επιβολής, αποκαλύπτοντας αποκλίνουσα γονιδιακή έκφραση και των δύο ισομορφών και προτείνοντας τον πιθανό ρόλο του GAPDH 1 ως γονίδιο μητρικής δράσης. Η μελέτη της εξειδίκευσης σε συγκεκριμένους ιστούς χρήζει περαιτέρω διερεύνησης.
(EL)
Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) is of principal role in basic cell catabolic processes and in the pathway of energy. It was considered as a housekeeping gene due to its stable expression at high levels in most tissues and cells under all conditions. For this reason, GAPDH is commonly used as an internal control for RT-PCR studies. However, recent evidence for differential expression patterns in different organisms and tissues as well as the occurrence of different isoforms and pesudogenes, driving to the result that it is necessary to reassess its role of internal control. In addition to this, GAPDH is involved in transcription, apoptosis and several other functions.
In the present study, we isolated the two isoforms GAPDH 1 and GAPDH 2 of the gilthead sea bream (Sparus aurata) and the European sea bass (Dicentrarchus labrax) and described the way of the identification and characterization. We performed an in silico phylogenetic analysis of both GAPDH paralogues in 10 fish species, including sea bream and sea bass, as well as test of selection. No positive selection was detected. In contrast, negative selection was detected.
Moreover, we studied the gene structure of both isoforms and the syntenic relationships among fish species with known genomes.
We further investigated the gene expression patterns of both isoforms in sea bream and sea bass in different developmental stages and tissues using RT-qPCR method and One-step RT-PCR respectively. The selected range of developmental stages for
9
sea bass was from the morula stage to the hatched stage. As for sea bream was from the gastrula stage to the stage of eye pigmentation as well as further stages of early development (from two cell stage to gastrula), showing divergent gene expression of the two isoforms and suggesting the possible function of GAPDH 1 as a maternal gene.
Further investigation is needed for the tissue-specificity of GAPDH isoforms.
(EN)
