Isolation and characterization of PhotosystemII-core subcomplexes from higler plants and study of the mode of action of inhibitors

This item is provided by the institution :

Repository :
E-Locus Institutional Repository
see the original item page
in the repository's web site and access all digital files if the item*

PhD thesis (EN)

1999 (EN)
Απομόνωση και χαρακτηρισμός υποσυμπλόκων του πυρήνα του φωτοσυστήματος II των ανωτέρων φυτών και μελέτη του μηχανισμού δράσης αναστολέων
Isolation and characterization of PhotosystemII-core subcomplexes from higler plants and study of the mode of action of inhibitors

Spyridaki, Aspasia
Σπυριδάκη, Ασπασία

Γανωτάκης, Δημήτριος

1. Με στόχο τη δομική μελέτη του πυρήνα του φωτοσυστήματος ΙΙ αναπτύχθηκαν νέοι μέθοδοι για την απομόνωση διαφόρων υποσυμπλόκων του PSII-core. Τα σύμπλοκα αυτά, που περιείχαν τις απαραίτητες υπομονάδες για την διεξαγωγή του πρωτοταγούς διαχωρισμού φορτίου, είναι τα εξής: α) Σύμπλοκο που περιέχει τις πρωτεΐνες 47 kDa, 32 kDa (D1), 34 kDa (D2), και το Cyt b559, β) Σύμπλοκο που περιέχει τις παραπάνω πρωτεΐνες, καθώς επίσης και την εσωτερική κεραία, 43 kDa πρωτεΐνη και γ) Σύμπλοκο που περιέχει όλες τις πρωτεΐνες που απαιτούνται για την έκλυση οξυγόνου (47 kDa, 43 kDa, 32 kDa, 34 kDa, Cyt b559 και 33 kDa). Τα σύμπλοκα απομονώθηκαν με εκλεκτική διαλυτοποίηση του φωτοσυστήματος ΙΙ με διάφορα απορρυπαντικά και στη συνέχεια με τεχνικές ιοντοανταλλακτικής χρωματογραφίας και υπερφυγοκέντρησης ζώνης. Όλα τα σύμπλοκα χαρακτηρίστηκαν με οπτική φασματοσκοπία απορρόφησης, φασματοσκοπία EPR και χρησιμοποιήθηκαν σε πειράματα τρισδιάστατης κρυστάλλωσης. Εξετάστηκαν όλοι οι βασικοί παράγοντες που σχετίζονται με την κρυστάλλωση μεμβρανικών πρωτεϊνών. Επιπλέον, εξετάστηκε η δράση της ιστιδίνης στις πρωτεΐνες του πυρήνα του φωτοσυστήματος ΙΙ, με στόχο τη σταθεροποίηση του συστήματος. Λήφθηκαν διάφορες κρυσταλλικές μορφές και οι καλύτεροι κρύσταλλοι μελετήθηκαν με κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ. 2. Για τον εντοπισμό της θέσης των εξωτερικών πρωτεϊνών έγιναν μελέτες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σε PSII-core σύμπλοκα, από τα οποία είχαν επιλεκτικά απομακρυνθεί οι πρωτεΐνες αυτές. Επιπλέον, αναπτύχθηκαν κυλινδρικοί κρύσταλλοι ενός PSII-core συμπλόκου, οι οποίοι εξετάστηκαν με ηλεκτρονική κρυσταλλογραφία. Από τις μελέτες αυτές λήφθηκαν πληροφορίες για τη κατάσταση ολιγομερισμού του PSII, καθώς και τη σχετική συναρμολόγηση και τοπολογία των υπομονάδων του. 3. Βρέθηκε ένας καινούριος αναστολέας, που αποτελεί φυσικό προϊόν, η καψακίνη. Η ένωση αυτή έχει την ικανότητα να παρεμποδίζει την ηλεκτρονιακή μεταφορά στο φυτικό PSII καθώς και στο βακτηριακό RC, στη θέση QΒ. Η ανασταλτική δράση της καψακίνης μελετήθηκε με μετρήσεις του ρυθμού έκλυσης Ο2 και φθορισμό στη περίπτωση του PSII, ενώ στο βακτηριακό RC χαρακτηρίστηκε με φασματοσκοπία απορρόφησης επαγώμενη με παλμούς φωτός. Λόγω της απουσίας μιας αναλυτικής δομής του PSII, χρησιμοποιήθηκε ως μοντέλο το βακτηριακό κέντρο αντίδρασης από Rb. sphaeroides. Η κρυσταλλογραφική ανάλυση του RC με δεσμευμένη καψακίνη παρείχε δομικές πληροφορίες για τις αλληλεπιδράσεις καψακίνης-πρωτεΐνης. (EL)
1. New methods were developed for the purification of several PSII-core subcomplexes in order to study the structure of the photosystem II core. The complexes, which contained the neccesary subunits to carry out the primary charge separation, were the following: a) A complex which contains the proteins: 47 kDa, 32 kDa (D1), 34 kDa (D2), and Cyt b559 b) A complex which contains the above proteins as well as the second interior antenna protein 43 kDa and c) A complex which contains all the proteins required for oxygen evolution (47 kDa, 43 kDa, 32 kDa, 34 kDa, Cyt b559 and 33 kDa) The complexes were isolated by using selective solubilization of Photosystem II with different detergents, ion exchange chromatography and zonal centrifugation. The above complexes were characterized by optical absorption spectroscopy, EPR spectroscopy and were used for three dimensional crystallization trials. The basic parameters which influence membrane protein crystallization were screened. Additionally, the action of histidine (a known oxygen radical scavenger) was examined on PSII-core proteins, in order to stabilize the system. Several crystal forms were obtained and the best crystals were measured by X-ray crystallography. 2. In order to localize the extrinsic proteins, electron microscopy measurements were carried out on solubilized PSII-core complexes, from which these proteins had been selectively extracted. Two dimensional crystals of a PSII-core complex were formed and were analyzed by electron crystallography. Information on the oligomerization state of PSII, the relative assembly and subunit topology was obtained from these studies. 3. A new naturally occuring inhibitor, capsaicin, was found, which has the ability to block the electron transfer of both plant PSII and bacterial RC, at the QB site. The mode of action of capsaicin was investigated by O2 evolution and fluorescence induction measurements in the case of PSII and flash-induced absorbance spectroscopy in the case of the bacterial RC. In the absence of a high resolution structure of PSII, the bacterial RC from Rb. sphaeroides was used as a model for investigating capsaicin binding to the QB-site. X-ray crystallographic analysis of the RC with bound capsaicin provided structural details of capsaicin-protein interactions. (EN)

Τύπος Εργασίας--Διδακτορικές διατριβές



Σχολή/Τμήμα--Σχολή Θετικών και Τεχνολογικών Επιστημών--Τμήμα Χημείας--Διδακτορικές διατριβές

*Institutions are responsible for keeping their URLs functional (digital file, item page in repository site)