Η πρωτεϊνη virp1 (viroid binding protein1), απομονώθηκε στο εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας Φυτών, του Πανεπιστημίου Κρήτης, ύστερα από σάρωση c-DNA βιβλιοθήκης από φύλλα τοματιάς, χρησιμοποιώντας σαν ανιχνευτή το RNA του PSTVd(E. Martinez, 2000). Θέλοντας να διερευνήσουμε το ρόλο της πρωτεϊνης virp1 στο κύτταρο, αλλά και σε συνδυασμό με τη μόλυνση από το ιοειδές PSTVd, αποφασίσαμε το σχεδιασμό μιας χιμαιρικής κατασκευής της virp1 με τη GFP (Green Fluorescent Protein). Η στρατηγική που ακολουθήσαμε, ήταν το γονίδιο gfp, να συντηχθεί με το γονίδιο της virp1 διαρτηρώντας το σωστό πλαίσιο διαβάσματος, και η χίμαιρα που θα προκύψει να εκφραστεί μέσα σε φυτά. για το γονίδιο της GFP, χρησιμοποιήθηκε ο φορέας pAVA321, ο οποίος ανήκει σε μια σειρά φορέων κλωνοποίησης, ειδικά σχεδιασμένων για την έκφραση χιμαιρικών πρωτεϊνών με το GFP, σε φυτικά κύτταρα(A.G. Von Arnim et al., 1998).Η χιμαιρική κατασκευή μεταφέρθηκε στο δυαδικό φορέα pART27, κατάλληλο για μετασχηματισμό φυτών μέσω Αγροβακτηρίου. Με το Αγροβακτήριο το οποίο έφερε τη χιμαιρική κατασκευή, μετασχηματίσαμε φυλλικούς δίσκους N.benthamiana και τελικά ακολουθώντας ένα πρωτόκολλο αναγέννησης, πήραμε διαγονιδιακά φυτά gfp-virp1 N.benthamiana.Τα φυτά αυτά μελετήθηκαν στο μικροσκόπιο για εντοπισμό της χιμαιρικής πρωτείνης.
(EL)
Virp1 (viroid binding protein 1), is a tomato protein that specifically interacts with viroids (A.E. Martinez, 2000). In order to elucidate the role of the protein in the cell and in the connection with viroid infection, we have designed and constructed a chimeric protein of Virp1 with GFP (green fluorescent protein). the vector pAVA321 with the gfp gene that was used, belongs to a series of vectors, especially designed for the construction of fusion proteins (A.G. von Arnim et al.,1998). The chimeric gene was transferred to the binary vector pART27, suitable for Agrobacterium mediated plant transformation. Stable transformation of N.benthamiana plants was achieved by cocultivation of leaf disks from N.benthamiana with Acrobacterium carrying the chimeric construction and further by using a regeneration protocol. This procedure resulted in the generation of N.benthamiana transgenic plants, which were analyzed by means of microscopic investigation, for localization of the chimeric protein.
(EN)
