H φωσφορυλίωση σερίνης της BACH1 ορίζει τον υποπυρηνικό εντοπισμό της

This item is provided by the institution :
University of Crete
Repository :
E-Locus Institutional Repository
see the original item page
in the repository's web site and access all digital files if the item*

2012 (EN)
H φωσφορυλίωση σερίνης της BACH1 ορίζει τον υποπυρηνικό εντοπισμό της

Μπακογιάννη, Σοφία

Σπηλιανάκης, Χαράλαμπος

Η πολυεπίπεδη οργάνωση του γονιδιώματος και ανώτερες δομές της χρωματίνης είναι καίρια χαρακτηριστικά του πυρήνα ανώτερων οργανισμών. Πρόσφατες έρευνες καταδεικνύουν ότι τόσο η υποπυρηνική τοποθέτηση των γενετικών τόπων όσο και οι χρωμοσωμικές αλληλεπιδράσεις του γονιδιώματος (ενδοχρωμοσωμικές & διαχρωμοσωμικές) μέσα στον πυρήνα παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Παρόλο που η ύπαρξη διαχρωμοσωμικών αλληλεπιδράσεων, ήταν γνωστή από την απενεργοποίηση του Χ-χρωμοσώματος στα θηλυκά άτομα θηλαστικών, άρχισε να γίνεται ευρέως αποδεκτή το 2005, όταν εντοπίστηκε στα παρθένα CD4+ T λεμφοκύτταρα. Σημαντικός κρίθηκε ο χαρακτηρισμός των πρωτεϊνικών συμπλόκων που επάγουν ή/και σταθεροποιούν διαχρωμοσωμικές αλληλεπιδράσεις σε CD4+ κύτταρα ποντικού. Για το λόγο αυτό έγινε επιλογή μιας περιοχής που έχει δειχτεί ότι συμμετέχει σε διαχρωμοσωμικές αλληλεπιδράσεις: της RHS6 εντός του ρυθμιστικού στοιχείου LCR του Th2 γενετικού τόπου, και πιο συγκεκριμένα μιας περιοχής 151 βάσεων DNA εντός αυτής, η οποία παρουσιάζει συντήρηση μεταξύ ανθρώπου και ποντικού καθώς και υπερευαισθησία στην πέψη με DNAάση. Μέσω χρωματογραφίας συγγένειας DNA για την περιοχή αυτή και φασματοσκοπίας μάζας έχει βρεθεί ότι από τις πρωτεΐνες που προσδέθηκαν, αυτές που ταυτοποιήθηκαν και δύναται να μεσολαβούν σε μεγάλης κλίμακας DNA αλληλεπιδράσεις ήταν οι πρωτεΐνες SATB1 και BACH1, στις οποίες μάλιστα αναγνωρίστηκε και μία μη χαρακτηρισμένη φωσφορυλίωση στην κάθε μία. Μία φωσφορυλίωση αναγνωρίστηκε στο κατάλοιπο Ser635 της πρωτεΐνης SATB1 και μία στο κατάλοιπο Ser448 της BACH1. Στα πλαίσια της παρούσας εργασίας προσπαθήσαμε να διαλευκάνουμε αν αυτή η θέση της φωσφορυλίωσης που εντοπίστηκε σε κάθε μία από τις δύο πρωτεΐνες, ευθύνεται για την υποκυτταρική της τοποθέτηση. Για τη μελέτη του υποκυτταρικού εντοπισμού, πραγματοποιήθηκε κλωνοποίηση των κωδκών περιοχών των γονιδίων (cDNA) και μετάλλαξη του καταλοίπου σερίνης σε αλανίνη και στη συνέχεια σύντηξη του υπό μελέτη γονιδίου (αγρίου τύπου και μεταλλαγμένου) με το γονίδιο της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (GFP) σε ευκαρυωτικό φορέα έκφρασης (pEGFP-c3). Ακολούθως, έγινε διαμόλυνση ΗΕΚ 293 T κυττάρων με φορέα έκφρασης (pEGFP-c3) που εκφράζει την αγρίου τύπου BACH1 πρωτεΐνη σε σύντηξη με την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (EGFP) όπως επίσης και με φορέα έκφρασης (pEGFP-c3) που εκφράζει τη μεταλλαγμένη BACH1 πρωτεΐνη (Ser448Α) σε σύντηξη με την EGFP. Σε κάθε περίπτωση μελετήθηκε η υποκυτταρική τοποθέτηση των χιμαιρικών πρωτεϊνών με τη χρήση μικροσκοπίας και βρέθηκε ότι, ενώ η μεν αγρίου τύπου BACH1 πρωτεΐνη εντοπίζεται κυρίως στον πυρήνα, η δε μεταλλαγμένη BACH1 πρωτεΐνη παρουσιάζει κυρίως κυτταροπλασματική κατανομή, υποδεικνύοντας ότι αυτό το αμινοξύ είναι κρίσιμος παράγοντας για τον πυρηνικό εντοπισμό της BACH1. Παρά τις επανειλημμένες προσπάθειες που έγιναν για την κλωνοποίηση του γονιδίου SATB1, αυτές δεν κατέστησαν δυνατές χωρίς την παρουσία μεταλλάξεων, με συνέπεια να μην επιτευχθεί και η μετάλλαξή του. Παρόλα αυτά εντοπίσαμε μία νέα ισομοφρή SATB1 που περιέχει ένα επιπλέον εξώνιο 91 βάσεων και ομοιάζει με μία αντίστοιχη ισομορφή του ανθρώπου. (EL)
Genome organization and high order chromatin structure are key features in the highly compartmentalized and dynamic environment of the eukaryotic cell nucleus. Recent investigations have indicated that gene positioning and chromosomal interactions (cis & trans) in the nucleus may play an important role in the regulation of gene expression. Although, interchromosomal interactions are a well-characterized phenomenon from the X-chromosome inactivation in female mammals, it is widely accepted since 2005, when detected in naive CD4+ T lymphocytes. Therefore, it was of great importance to identify and characterize protein complexes that induce and/or stabilize interchromosomal interactions in mouse CD4+ T cells. For this reason, RHS6, which is a regulatory region within the TH2 locus and was recently found to participate in interchromosomal interactions, was chosen as a candidate region for study. Moreover, we focused οn 151 bases within RHS6, which show considerable conservation between human and mouse. By utilizing DNA affinity chromatography coupled with Mass Spectrometry, we identified two specific DNA binding factors, namely SATB1 and BACH1 and mapped one phosphorylation site for each of them. The phosphorylated residues identified were S635 and S448, corresponding to proteins SATB1 and BACH1. In the frame of this study, we tried to elucidate whether serine phosphorylation, detected in each one of the two proteins was responsible for the subcellular localization of these proteins. Therefore, we made efforts for gene cloning and site-directed mutagenesis of serine residues to alanine, followed by fusion of the genes of interest (wild type and mutant) with the reporter gene of green fluorescent protein (EGFP) to an expression vector. Subsequently, we performed transfection of HEK 293 T cells with the expression vector pEGFP-c3 that expresses wild-type BACH1 protein in fusion with green fluorescent protein (EGFP), as well as with pEGFP-c3 that expresses the mutant BACH1 protein (Ser448A) in fusion with EGFP. In each case, we studied the subcellular localization of the chimeric proteins by using fluorescence microscopy and found that while the wild type BACH1 protein localized mainly in the nucleus, the mutant BACH1 exhibited mostly a cytoplasmic distribution, indicating that serine phosphorylation is a potential determinant for the nuclear localization of BACH1 protein. Despite repeated efforts for the initial cloning of the SATB1 gene, this was not possible due to missense mutations incorporated into the cDNA although a proofreading polymerase was used. However, we identified a new isoform of SATB1 containing an additional exon of about 100 bases, which resembles with a corresponding human SATB1 isoform. (EN)

Τύπος Εργασίας--Πτυχιακές εργασίες

CD4+ Τ

Πανεπιστήμιο Κρήτης (EL)
University of Crete (EN)



Σχολή/Τμήμα--Σχολή Θετικών και Τεχνολογικών Επιστημών--Τμήμα Βιολογίας--Πτυχιακές εργασίες

*Institutions are responsible for keeping their URLs functional (digital file, item page in repository site)