Ο δονητικός χαρακτηρισμός των ενδιαμέσων και ο προσδιορισμός της δομής τους τόσο στην αναγωγή του μοριακού οξυγόνου, όσο και την ενεργοποίηση του NO από μια ομάδα ενζύμων γνωστών ως κυτοχρωμικές c οξειδάσες (CcO) και την ανα-γωγάση του μονοξειδίου του αζώτου (Nor), αντίστοιχα, αποτελεί βασικό βήμα στην κατανόηση των βιοενεργετικών αυτών μηχανισμών. Το O2 και το NO αποτελούν υ-ποστρώματα σε ένζυμα της αναπνοής και της απονιτροποίησης, διαδικασιών που α-ποδίδουν ενέργεια στα θηλαστικά και τα βακτηρία. Η πρώτη ενότητα της παρούσας διατριβής αναφέρεται στην ενεργοποίηση του μοριακού οξυγόνου. Αφού διασαφηνί-σουμε ενδελεχώς τη θέση των τελικών οξειδασών στο χαώδες δίκτυο των μεταβολι-κών μονοπατιών, περιγράφουμε εισαγωγικά στο πρώτο κεφάλαιο τόσο τα δομικά χα-ρακτηριστικά, όσο και τη λειτουργία τους. Το ενεργό κέντρο της CcO είναι μια διπυ-ρηνική κοιλότητα αποτελούμενη από μία αίμη υψηλής διαμόρφωσης spin και ένα άτομο χαλκού, τον CuB. Η δεύτερη ενότητα διαπραγματεύεται επιπλέον τη χημεία του μονοξειδίου του αζώτου στα βιολογικά συστήματα, ενώ η εισαγωγή του έβδομου κεφαλαίου περιλαμβάνει μια σύντομη αναφορά στη διαδικασία της απονιτροποίησης και τις αναγωγάσες Nor. Στη Nor, το ενεργό κέντρο του ενζύμου αποτελείται από μία αίμη υψηλής διαμόρφωσης spin και ένα άτομο μη-αιμικού FeB. Αρχικά μελετήθηκε, με θεωρητικούς υπολογισμούς DFT, η δυναμική του με-ταλλικού κέντρου χαλκού στις κυτοχρωμικές c οξειδάσες που αποτελεί και το σημείο εισόδου του υποκαταστάτη O2 στο ενεργό κέντρο. Μελετάται η δονητική συμπεριφο-ρά του συστήματος CuB-CO συναρτήσει αλλαγών στη σφαίρα συναρμογής του χαλ-κού. Οι υποκαταστάτες (τρεις ιστιδίνες και η ομοιοπολικά δεσμευμένη σε μία από αυτές cross-linked τυροσίνη) του CuB διατηρούνται πρωτονιωμένοι και συναρμοσμέ-νοι στον CuB τόσο κατά τη δέσμευση του CO όσο και σε εύρος pH 5.5-10. Υπολογι-σμοί στο κέντρο του μεταλλικού χαλκού πραγματοποιούνται προσομοιώνοντας επι-πλέον και την ενεργή κοιλότητα του cbb3, όπου απουσιάζει η cross-linked τυροσίνη με τα ίδια συμπεράσματα. Ο θεωρητικός χαρακτηρισμός του κέντρου αυτού στις CcO παρέχει πρόσβαση στο φασματοσκοπικά σιωπηλό χαλκό, αποδεικνύοντας ότι οι υποκαταστάτες του δε συμμετέχουν σε διαδικασίες μεταφοράς πρωτονίων. Επεκτείνοντας τους θεωρητικούς υπολογισμούς σε μοντέλα που περιέχουν πε-ρισσότερο από 100 άτομα προχωράμε στην ερμηνεία της ύπαρξης δύο διαφορετικών οξο-φερρύλ διαμορφώσεων (804 και 790 cm-1) στον καταλυτικό κύκλο της κυτοχρω-μικής c οξειδάσης που αποδίδονται αποκλειστικά σε αλληλεπιδράσεις του αξονικού υποκαταστάτη του αιμικού σιδήρου με το δίκτυο των δεσμών υδρογόνου στην εγγύς περιοχή. Προσδιορίζουμε τις πιθανές αλλαγές στην εγγύς περιοχή που παράγουν τα είδη 804/ 790 cm-1 και προτείνουμε ένα μηχανισμό που οδηγεί σε αυτά. Περιγράφεται επιπλέον η δυναμική του ενζύμου στη μετάβαση P -> F από την πρωτονίωση του κα-ταλοίπου E278 στο D-πρωτονιακό κανάλι μέχρι τη διαμόρφωση της εγγύς περιοχής. Σε συνέχεια της προηγούμενης μελέτης διερευνώνται τόσο οι μακρινές όσο και οι εγγύς αλληλεπιδράσεις που επηρεάζουν τη συχνότητα δόνησης τάσης ν(Fe-O) στα ενδιάμεσα όξυ και υδρόξυ. Σε αντίθεση με την ισχύ των εγγύς αλληλεπιδράσεων στο οξο-φερρύλ είδος, στο υδρόξυ είδος αυτό που καθορίζει τις διαφορετικές διαμορφώ-σεις (450/ 475 cm-1) είναι κατά κύριο λόγο ένας δεσμός υδρογόνου στη μακρινή πε-ριοχή, ενώ το όξυ ενδιάμεσο παρουσιάζει μια μόνο διαμόρφωση με ν(Fe-O) στους 568 cm-1. Περνώντας στη χημεία του NO στη βακτηριακή απονιτροποίηση, προσδιορί-ζουμε θεωρητικά, δονητικά και δομικά, το ενδιάμεσο-κλειδί στον καταλυτικό κύκλο της αναγωγάσης του μονοξειδίου του αζώτου στο στάδιο δημιουργίας του δεσμού ΝΝ. Προτείνουμε το μηχανισμό ενεργοποίησης του NO βάσει της δομής του υπονι-τρώδους (HO-N=N-O-) ενδιάμεσου που προσδιορίστηκε στο ενεργό κέντρο Fea33+/ FeB2+ της Nor και τον συγκρίνουμε με το στάδιο της δημιουργίας του δεσμού ΝΝ στη κυτοχρωμική οξειδάση ba3. Η πολωσιμότητα των αερίων O2, CO και NO στις κοιλότητες των ενζύμων και πρωτεϊνών και πώς αυτή αντικατοπτρίζεται στις αντίστοιχες δονήσεις τάσης των δια-τομικών αυτών μορίων αποτελεί επίσης αντικείμενο μελέτης. Η δυνατότητα δημιουρ-γίας δεσμών υδρογόνου και οι ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις στις κοιλότητες αυ-τές οδηγούν σε σημαντικές μετατοπίσεις των ν(O-O), ν(N-O) και ν(C-O) που σε ορι-σμένες περιπτώσεις πλησιάζουν αυτές που οφείλονται στη δέσμευσή τους στα μέταλ-λα Fe και CuB. Τέλος, είναι σημαντικό να αναφέρουμε ότι υπό μελέτη συστήματα όπως τα πα-ραπάνω προσεγγίστηκαν με μοντέλα που περιλάμβαναν μέχρι και 130 άτομα καθώς επίσης στις περισσότερες των περιπτώσεων δύο μεταβατικά μέταλλα, καθιστώντας τους καθαρά ab initio υπολογισμούς εξαιρετικά χρονοβόρους. Ωστόσο, η μέθοδος DFT κατάφερε να εισχωρήσει στα ενεργά κέντρα των ενζύμων και να αντλήσει πλη- ροφορίες σε ατομικό επίπεδο άλλοτε ενισχύοντας τα πειραματικά δεδομένα και άλλο-τε καθορίζοντας την ερμηνεία τους, με έμφαση στη δυναμική των ενζύμων.
(EL)
Vibrational and structural characterization of the intermediates in processes like the reduction of molecular oxygen and NO activation by cytochrome c oxidases (CcO) and nitric oxide reductases (Nor), respectively, is a crucial step in the under-standing of O2 and NO bioenergetics. Both O2 and NO act as substrates of respiration and denitrification enzymes, which are metabolic pathways yielding energy in mam-malian and bacterial cells. The first section of this thesis refers to molecular oxygen activation. After identifying the place of terminal oxidases in the chaotic pathways of metabolism, we make an introduction to their structural and functional characteristics (chapter I). The active site of CcO is a binuclear center composed of a high spin heme iron and a copper site (CuB). The second section is consent, additionally, with NO chemistry in biological systems, while the introduction of chapter VII contains a short reference on the denitrification process and nitric oxide reductases. In Nor, the active site is composed of a high spin heme iron and a non-heme FeB. Initially, a DFT study was conducted to probe the dynamics of CuB metal center in cytochrome c oxidases, as this site is the entrance of substrate O2 to the binuclear site. CuB-CO vibrational characterization in relation to changes in the coordination sphere of copper are of high interest. CuB linands (three histidines and the covalently cross-linked tyrosine) remain protonated and coordinated to CuB upon CO addition and at pH 5.5-10 range. cbb3s CuB site lacks the cross-linked tyrosine, but exerts the same behavior. Theoretical characterization of copper metal site in CcO gives insight into the spectroscopically silent metal, proving that its ligands do not take active role in processes like proton translocation in CcO catalytic cycle. Extending theoretical calculations to models of active site containing more than 100 atoms we investigated the presence of two different oxo-ferryl conformations (804 and 790 cm-1) in the catalytic cycle of cytochrome c oxidase. These two species are attributed to two different conformations of the heme iron axial ligand with and without hydrogen bonding interactions in the proximal area. We characterized possi-ble changes in proximal area that yield the 804/ 790 cm-1 species and proposed a mechanistic pathway of oxygen activation by CcO based on the new findings. More-over we drew a possible connection between E278 in the D-proton pathway and proximal area during the P F transition. In correlation to the previous study, we investigated proximal and distal effects that shift ν(Fe-O) vibrational stretching frequency in oxy and hydroxy intermediates of CcO/ O2 reaction. In contrast to oxo-ferryl species, the hydroxy intemediate appears in two different conformations (450/ 475 cm-1) mainly due to a distal hydrogen bond, while oxy intermediate exerts a single ν(Fe-O) at 568 cm-1 consistent with only one conformation. Turning to NO biochemistry in bacterial denitrification we characterized theo-retically the key-intermediate in the catalytic cycle of nitric oxide reductase in the step of ΝΝ bond formation. We proposed a mechanistic pathway of NO activation based on the hyponitrite (HO-N=N-O-) structure determined in the Fea33+/ FeB2+ active site of Nor and we compared it to that of ΝΝ formation in ba3 cytochrome oxidase. The polarizability of O2, CO and NO free gases in enzyme or protein cavities and the way that this is altering their vibrational stretching frequencies is of great im-portance in identifying such structural sites. Hydrogen bonds or electrostatic interac-tions present in these cavitties lead to significant ν(O-O), ν(N-O) and ν(C-O) shifts in a way that in certain cases reassembles the binding of these gases to Fe or CuB. To conclude, its of great importance to understand that enzymatic systems un-der study, like those mentioned above, were modeled with complexes containing up to about 130 atoms and in most cases with two transition metals, forcing pure ab initio calculations to be extremely time-consuming. DFT method was able to intrude in ac-tive sites of heme proteins and extract information in atomic level either enforcing experimental data or determining their interpretation with great impact on enzyme dynamics.
(EN)
