Η Hey ανήκει στην οικογένεια των b-HLH-O πρωτεϊνών, και πρόσφατα έχει βρεθεί ότι είναι στόχος του Notch μονοπατιού. Στο ιντρόνιο 2 και στο ανοδικό κομμάτι του γονιδίου Hey ανακαλύφθηκαν, σε Chip on chip πειράματα (Ε. Ζαχαριουδάκη, Χ. Δελιδάκης, S.Bray, αδημοσίευτα δεδομένα), θέσεις πρόσδεσης της Su(H), η οποία είναι γνωστό ότι δρα σαν συμπαράγοντας του Notch. Αυτές οι περιοχές έχουν κλωνοποιηθεί σε φορείς μετασχηματισμού Drosophila, με γονίδιο αναφοράς τη β-γαλακτοσιδάση (bgal), που έχουν ενεθεί σε έμβρυα δημιουργώντας αντίστοιχες διαγονιδιακές σειρές της Drosophila melanogaster. Ανοσοϊστοχημικές μελέτες και συνεστιακή ανάλυση απεκάλυψαν το πρότυπο έκφρασης της bgal στο κεντρικό σύστημα (ΚΝΣ), περιφερικό νευρικό σύστημα (ΠΝΣ), αλλά και στο αναπτυσσόμενο μεσέντερο του εμβρύου και στο ΚΝΣ της προνύμφης. Μόνο στις σειρές του ιντρονίου 2 υπήρξε έκφραση της bgal, η οποία συνεντοπίζεται με το ενδογενές Hey. Εξαίρεση αποτελούν οι περιοχές των mushroom bodies των εγκεφαλικών λοβών της προνύμφης, καθώς και περιοχές του ΚΝΣ του εμβρύου, όπου η έκφραση του Hey δεν εξαρτάται από το Νotch μονοπάτι και στις οποίες δεν παρατηρήθηκε έκφραση της β-γαλακτοσιδάσης, ενισχύοντας την πρόβλεψη ότι η ενεργοποίηση του ιντρονίου 2 γίνεται μέσω του Notch. Επιπλέον σε κλώνους όπου το Notch μονοπάτι έχει καταστραφεί, καταστέλλεται η έκφραση της ενδογενούς πρωτεΐνης Hey αλλά και της β-γαλακτοσιδάσης, γεγονός που οδηγεί στο συμπέρασμα ότι η ενεργοποίηση του ιντρονίου 2 γίνεται μέσω του Notch. Προσδιορίστηκε σε πειράματα στο ΚΝΣ του εμβρύου ότι υπάρχει σταθερότητα της bgal σε σύγκριση με την παροδική έκφραση του Hey. Στο ΠΝΣ φαίνεται ότι τα περισσότερα Hey/ bgal θετικά είναι και Elav θετικά κύτταρα άρα νευρώνες, αλλά υπάρχει μικρός αριθμός Hey/ bgal θετικών κυττάρων που είναι θετικά για repo (marker για γλοιακά κύτταρα). Στο μεσέντερο του εμβρύου παρατηρήθηκαν Hey/ bgal θετικά κύτταρα τα οποία επίσης εκφράζουν Prospero, πρωτεΐνη που χαρακτηρίζει τα εντεροενδοκρινή κύτταρα, ενώ υπάρχει και ένας πληθυσμός κυττάρων τα οποία είναι bgal θετικά απουσία Hey. Ερευνήθηκε, επίσης, σε S2 κύτταρα εάν υπάρχει ενεργοποίηση των cis ρυθμιστικών στοιχείων του γονιδίου Hey από το Notch μονοπάτι. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το ιντρόνιο 2 ενεργοποιείται μέσω του Notch στα S2 κύτταρα, ενώ το ανοδικό κομμάτι δεν ενεργοποιείται.
(EL)
Hey is a b-HLH-Ο protein, which has recently been found to be a target of Notch pathway. Chip-on-chip experiments (E.Zaxarioudaki, C. Delidakis and S. Bray, unpublished data) revealed binding sites of Su (H), a coactivator of Notch, in the upstream region and in the intron 2 of Hey. Those regions have been cloned in transformation vectors with a bgal reporter and respective Drosophila transgenic lines have been generated. Immunohistochemical studies and confocal analysis of these lines have revealed the pattern of bgal expression in embryonic PNS, CNS, and gut and in the larval brain. Only the intron 2 reporter lines showed bgal staining that coincides with Hey endogenous expression. On the other hand, the mushroom bodies of larval brain and regions in embryonic CNS where Hey is not expressed via the activated Notch pathway were areas with no expression of bgal suggesting that the activation of intron 2 is dependent on Notch signaling. Moreover, in clones where Notch signaling has been suppressed, besides endogenous Hey, bgal expression was also lost. In specific embryonic CNS cell lineages we observed perdurance of bgal protein versus the transient expression of Hey. In embryonic PNS the majority of Hey/bgal positive cells are also Elav positive, but there are also few Hey/bgal positive cells that are repo positive suggesting that Hey is also expressed in some glial cells in PNS. We also observed Hey/ bgal positive cells in the developing midgut of embryos. In addition we investigated whether the enhancers are activated by Notch in S2 cell lines. In this system as well we found that the intron 2 enhancer is activated while the promoter fragment is not.
(EN)
