Η παρούσα εργασία εστιάζεται στην ανάπτυξη ενός βιοαισθητήρα ανίχνευσης
πολλαπλών δειγμάτων, βασισμένου σε μικροδιατάξεις επιφανειακών ακουστικών
κυμάτων (SAW). Η καινοτομία της ιδέας βρίσκεται στον τρόπο επίτευξης της
πολλαπλότητας ανάλυσης: αντί του «παραδοσιακού» τρόπου της χρήσης μιας
συστοιχίας από αισθητήρες, εδώ η πολλαπλότητα επιτυγχάνεται μέσω της
διαμερισματοποίησης της επιφάνειας ενός μόνο αισθητήρα σε υποπεριοχές, γεγονός
που επάγεται από τη χρήση μικρορευστομηχανικών διατάξεων.
Αρχικά επιλέχθηκε η κατάλληλη μικροδιάταξη αισθητήρα SAW ανάμεσα σε
δώδεκα διαφορετικές διαμορφώσεις (οι οποίες διέφεραν ως προς το υπόστρωμα, τη
συχνότητα λειτουργίας και το πάχος του κυματοδηγού) χρησιμοποιώντας
διαφορετικής φύσεως υλικά (με ελαστικό, ιξώδη και ιξωδοελαστικό χαρακτήρα) για
το χαρακτηρισμό. Τελικά χρησιμοποιήθηκε μια διάταξη διπλού αισθητήρα με
υπόστρωμα χαλαζία στα 155 MHz και με πάχος κυματοδηγού 0.70 μm. Ακολούθως,
σχεδιάστηκε η μικρορευστομηχανική διάταξη/κυψελίδα, με γνώμονα την ευελιξία και
απλότητα στη χρήση του συστήματος και λαμβάνοντας υπόψη λειτουργικούς και
γεωμετρικούς περιορισμούς που επιβάλλονταν από τη μικροδιάταξη του διπλού
αισθητήρα. Η μέθοδος κατασκευής της κυψελίδας ήταν η λιθογραφία μαλακής ύλης
του υλικού PDMS (τα βασικά βήματα της οποίας ήταν η ταχεία δημιουργία
πρωτοτύπου και η αντιγραφή του εκμαγείου) με την οποία κατασκευάστηκαν και
δοκιμάστηκαν επιτυχώς κυψελίδες με 3, 4, και 5 κανάλια.
Η επαναληψιμότητα και η ευαισθησία ελέγχθηκαν χρησιμοποιώντας υδατικά
διαλύματα γλυκερόλης και κάποιες συνήθεις πρωτεΐνες (νιουτραβιδίνη και
βιοτινυλιωμένη BSA, protein G και IgG). Η απόκλιση του σήματος μεταξύ των
σχηματισμένων υποπεριοχών ήταν μικρότερη από 10% σε όλες τις περιπτώσεις.
Η απόδειξη της λειτουργίας του μικροσυστήματος ως πολυ-δειγματικού
αναλυτή, έγινε με χρήση τεσσάρων διαφορετικών βιοτινυλιωμένων πρωτεϊνών. Κάθε
πρωτεΐνη εισήλθε σε έναν υποχώρο του μικροσυστήματος και ανιχνεύθηκε η
αλληλεπίδρασή της με την ήδη προσροφημένη νιουτραβιδίνη. Η ανεξάρτητη
ανίχνευση των βιομορίων στους υποχώρους καθώς και η ανάλυση της κινητικής τους
έγιναν με επιτυχία. Η αξιοποίηση του μικροσυστήματος στο μέγιστο βαθμό του
πραγματοποιήθηκε όταν δύο διαφορετικοί υποδοχείς προ-ακινητοποιήθηκαν στους
δύο αισθητήρες και τέσσερα διαφορετικά δείγματα εισήχθησαν στα μικροκανάλια.
Έτσι ανιχνεύθηκαν συνολικά 8 διαφορετικές αλληλεπιδράσεις.
Η εφαρμογή του μικροσυστήματος σε δείγματα κλινικού ενδιαφέροντος
πραγματοποιήθηκε με χρήση καρδιακών δεικτών, όπου η ανίχνευση έγινε μέσω της
αλληλεπίδρασης αντιγόνου-αντισώματος. Οι τέσσερις δείκτες (CK-MB, CRP, Ddimer,
και PAPP-A) αναλύθηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις, διερευνήθηκαν τα όρια
λειτουργίας του μικροσυστήματος, και έγινε συσχετισμός με πραγματικές κλινικές
τιμές. Επίσης, επιτεύχθηκε επιλεκτική ανίχνευση των πρωτεϊνών μέσα από ένα μίγμα
όλων των διαθέσιμων δεικτών.
Τέλος, από τα πειράματα που έγιναν με όλα τα βιομόρια, προέκυψαν
συμπεράσματα και ενδιαφέροντα δεδομένα σχετικά με το συσχετισμό του
ακουστικού κύματος με ιδιότητες των βιομορίων (το μοριακό τους βάρος και την
ιξωδοελαστική τους φύση).
(EL)
This work focuses on the development of a multi-analyte biosensor, based on
a Surface Acoustic Wave (SAW) device. The novelty of the concept lies in the way of
achieving multiplicity: instead of the “traditional” way of a sensor element array,
multiplicity is induced by compartmentalization of a single sensor, achieved via
microfluidics (“microfluidics-on-SAW”, or “μF-on-SAW” setup).
Initially, the appropriate SAW device for the microsystem was selected among
twelve device configurations (varying in substrate, operating frequency and
waveguide thickness) upon loading with different classes of materials (mass, viscous,
viscoelastic). In particular, a dual quartz-based SAW biochip was used, operating at
155 MHz with 0.70 μm thick PMMA waveguide. Subsequently, the microfluidic
module was designed targeting flexibility and simplicity. Considering functional and
geometrical limitations imposed by the SAW biochip, the two components were
successfully assembled. The fabrication process for the microfluidic module was soft
lithography of PDMS (rapid prototyping and replica molding); 3-, 4-, and 5-channel
modules were made, all successfully tested, and the 4-channel one used in the project.
Reproducibility and sensitivity tests were carried out using aqueous glycerol
solutions, and standard protein biomolecules (neutravidin and biotinylated BSA, as
well as protein G and IgG). The standard deviation in the signal values among the
sub-areas was less than 10%, in all cases.
The proof-of-principle of multi-sample detection was achieved via four
biotinylated molecules. Each one was injected in one μF-on-SAW compartment and
interacted with pre-adsorbed neutravidin; separate detection of the analytes, kinetics
and equilibrium analysis were successfully demonstrated. Maximum multiplexity was
achieved when the two devices of the biochip were pre-functionalized with different
receptors, and four different samples were injected in each microchannel (altogether 8
probed interactions).
The final step was the application of μF-on-SAW in multi-sample detection of
clinical significance. In particular, cardiac markers were used, the detection of which
was realized via antibody-antigen interactions. The four cardiac markers (CK-MB,
CRP, D-dimer, and PAPP-A) were successfully detected individually and in various
concentrations; analytical curves were created for each biomarker and correlation to
the known physiological and pathological values was made. Eventually, by using the
μF-on-SAW it was feasible to selectively capture each marker out of a mixture or all
four, a proof that the system can potentially be used in body fluids (were many
“unwanted” species are present).
Finally, from the different groups of biomolecules detected throughout the
project, interesting results emerged concerning the interaction of acoustic waves with
biomolecules and the correlation of the acoustic signal with inherent properties of
biomolecules such as their molecular weight and viscoelastic nature.
(EN)
