Στόχος της παρούσας μελέτης ήταν η μελέτη του αναπαραγωγικού κύκλου του κρανιού (Argyrosomus regius) καθώς και η ορμονική πρόκληση της γαμετοτοκίας του με χρήση εμφυτευμάτων αγωνιστών της γοναδοεκλυτίνης (gonadotropin releasing-hormone agonist, GnRHa). Για την μελέτη του αναπαραγωγικού κύκλου πραγματοποιήθηκαν 7 δειγματοληψίες σε διάστημα 8 μηνών. Από 17/11/2009 έως 15/3/2010 οι δειγματοληψίες πραγματοποιούνταν κάθε δύο μήνες και στη συνέχεια (15/4/2010 – 16/7/2010) ανά μήνα. Χρησιμοποιήθηκαν 13 ψάρια (7 θηλυκά, 6 αρσενικά) αρχικού μέσου βάρους ± τυπική απόκλιση 3.828±647 g προερχόμενα από εκτροφή του ΕΛ.ΚΕ.Θ.Ε του 2005. Σε κάθε δειγματοληψία γινόταν έλεγχος του σταδίου της γαμετογένεσης με απαλή κοιλιακή μάλαξη στα αρσενικά και με λήψη βιοψίας από τις γονάδες στα θηλυκά. Σε περίπτωση που τα αρσενικά ήταν σπερμιάζοντα το σπέρμα φυλασσόταν σε πάγο και στη συνέχεια με χρήση κατάλληλης μεθοδολογίας (Computer Assisted Sperm Analysis, CASA) γινόταν εκτίμηση των βασικών χαρακτηριστικών της ποιότητάς του (παράρτημα). Στα θηλυκά άτομα πραγματοποιούνταν έλεγχος του νωπού δείγματος σε οπτικό μικροσκόπιο και μέρος της βιοψίας φυλάσσονταν σε μονιμοποιητικό διάλυμα προκειμένου να υποβληθεί σε ιστολογική εξέταση. Παράλληλα, γινόταν λήψη αίματος για την εκτίμηση της ποσότητας των στεροειδών ορμονών. Τεστοστερόνης (Testosterone, T) και Οιστραδιόλης (Estradiol, E2) για τα θηλυκά άτομα και Τεστοστερόνης και 11-Κετοτεστοστερόνης (11-Ketotestosterone, 11-KT) για τα αρσενικά. Τα ωοκύτταρα παρουσίασαν σταδιακή αύξηση της διαμέτρου τους κατά τη διάρκεια των δειγματοληψιών και τον Ιούνιο η διάμετρος σημείωσε την υψηλότερη τιμή της (574±11,5 μm). Αντίθετα, κατακόρυφη πτώση σημειώθηκε το μήνα Ιούλιο καθώς καταγράφηκε διάμετρος παρόμοια με του Νοεμβρίου και του Ιανουαρίου (128±8,4 μm). Ιστολογικά, οι γονάδες περιείχαν ωοκύτταρα σε διάφορα στάδια της ωογένεσης οδηγώντας στο συμπέρασμα ότι το είδος ωοτοκεί περισσότερες από μία φορές κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγικής του περιόδου. Από την ανάλυση του πλάσματος στα θηλυκά άτομα, οι μέγιστες τιμές καταγράφηκαν τον Μάιο (Τ=0,2 ng ml-1, E2=0,47 ng ml-1), ένα μήνα πριν την μέγιστη διάμετρο των ωοκυττάρων. Στη συνέχεια η συγκέντρωση της E2 μειώθηκαν όπως τους προηγούμενους μήνες, ενώ η T παρουσίασε ένα δεύτερο μέγιστο τον Ιούλιο (T=0,16 ng ml-1). Τα αρσενικά άτομα ήταν σπερμιάζοντα από τον Μάρτιο μέχρι τον Ιούνιο και παρήγαν σπέρμα σταθερής πυκνότητας (26,8±7 Χ109 szoa ml-1) και κινητικότητας (62,3±14,9 %). Η διάρκεια της κινητικότητας του σπέρματος επίσης παρέμεινε σταθερή (1,2±0,5 min) και παρουσίασε μέγιστο τον Απρίλιο (1,94±1,5 min). Από την ανάλυση του πλάσματος για την εκτίμηση του επιπέδου των στεροειδών ορμονών στα αρσενικά άτομα παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική μεταβολή και των δύο ορμονών με το χρόνο. Για την 11-KT η υψηλότερη τιμή σημειώθηκε τον Μάρτιο (0,8 ng ml-1) ενώ για την T τον Ιούλιο (0,3 ng ml-1). Οι χαμηλότερες τιμές σημειώθηκαν τον Νοέμβριο και για τις δύο ορμόνες. Ο μήνας έναρξης της σπερμίασης συμπίπτει με το μέγιστο της 11-KT ενώ το μέγιστο της T συμπίπτει με τον τελευταίο μήνα σπερμίασης.
Για την μελέτη της ορμονικής πρόκλησης της γαμετοτοκίας πραγματοποιήθηκαν πειράματα δύο διαδοχικά έτη (2009 – 2010). Το 2009 σε χρονικό διάστημα 45 ημερών πραγματοποιήθηκαν τρία πειράματα ομαδικής πρόκλησης γαμετοτοκίας. Εξετάστηκαν συνολικά 26 ψάρια (12 θηλυκά, 14 αρσενικά) από τα οποία τα 23 (11 θηλυκά, 12 αρσενικά) υποβλήθηκαν σε ορμονική αγωγή. Τα ψάρια τοποθετήθηκαν στις τρεις δεξαμενές στις 5/5/2009 (3 θηλυκά, 3 αρσενικά), στις 18/5/2009 (4 θηλυκά, 5 αρσενικά) και στις 9/6/2009 (4 θηλυκά, 4 αρσενικά) και είχαν αρχικό μέσο σωματικό βάρος 6.934±1.949 g. Έπειτα από έλεγχο της βιοψίας των θηλυκών ατόμων σε οπτικό μικροσκόπιο και έλεγχο σπερμίασης στα αρσενικά γινόταν χορήγηση εμφυτεύματος GnRHa σε δόση 430±150 mg και τα ψάρια επανατοποθετούνταν στην δεξαμενή όπου αναμενόταν η γαμετοτοκία. Η πρώτη ωοτοκία πραγματοποιήθηκε δύο ημέρες μετά την χορήγηση του εμφυτεύματος σε όλες τις περιπτώσεις ενώ η μέση ετήσια σχετική γονιμότητα εκτιμήθηκε στα 364.993 αυγά kg-1 και το ποσοστό γονιμοποίησης στο 85±2%. Τα αρσενικά άτομα που υποβλήθηκαν σε ορμονική θεραπεία, παρήγαγαν σπέρμα πυκνότητας 14±5,3 x109 szoa ml-1. Η κινητικότητά του υπολογίστηκε στο 78±6,8% και η διάρκεια της κινητικότητας στα 1,8±0,1 min. Η σχετική γονιμότητα και το ποσοστό γονιμοποίησης των θηλυκών αλλά και η πυκνότητα, η κινητικότητα και η διάρκεια κινητικότητας των αρσενικών δεν διέφεραν στατιστικά σημαντικά (ANOVA, p≤0,05). Την δεύτερη χρονιά (2010) διεξήχθηκαν τα ατομικά πειράματα ορμονικής πρόκλησης αναπαραγωγής. Σε δύο χρονικές στιγμές, στις 4/5/2010 και στις 3/6/2010, 3 θηλυκά και 6 αρσενικά άτομα αρχικού μέσου βάρους 8.238±2.190 g τοποθετήθηκαν σε 3 δεξαμενές σε αναλογία 1:2 ακολουθώντας την παραπάνω διαδικασία ελέγχου και χορήγησης εμφυτευμάτων. Η πρώτη ωοτοκία πραγματοποιήθηκε δύο ημέρες μετά την χορήγηση του εμφυτέυματος ενώ η μέση ετήσια σχετική γονιμότητα ήταν 434.860 αυγά kg-1. Το μέσο ποσοστό γονιμοποίησης ήταν 92±8%. και ο αριθμός των ωοτοκιών 11±5 ωοτοκίες. Έπειτα από την πρώτη ωοτοκία οι ωοτοκίες συνεχίζονταν για τουλάχιστον 5 ημέρες και έπειτα από παύση το πολύ δύο ημερών οι ωοτοκίες συνεχίζονταν. Η γονιμότητα παρουσίαζε μέγιστο στις πρώτες 4 ωοτοκίες και στη συνέχεια μειωνόταν σταδιακά μέχρι το τέλος των ωοτοκιών. Αντιθέτως το ποσοστό γονιμοποίησης παρέμεινε σταθερό πάνω από το 56,8% και σε ορισμένες περιπτώσεις άγγιξε και το 100%. Όσο αφορά τη γονιμότητα και το ποσοστό γονιμοποίησης δεν προέκυψε στατιστικά σημαντική διαφοροποίηση ούτε μεταξύ των ατόμων ούτε μεταξύ των δύο διαφορετικών χρονικών στιγμών (ANOVA, p≤0,05).
Συμπερασματικά λοιπόν, ο κρανιός έφερε ωοκύτταρα σε πλήρη λεκιθογένεση από τον Απρίλιο έως τον Ιούνιο, ενώ τα αρσενικά άτομα ήταν σπερμιάζοντα τους μήνες αυτούς. Από την προσπάθεια ορμονικής πρόκλησης γαμετοτοκίας και τον Μάιο και τον Ιούνιο καταγράφηκαν εξίσου θετικά αποτελέσματα ενώ η παραγωγή των αυγών υπολογίστηκε στο 40.768±36.911 αυγά kg-1 ωοτοκία-1 με ποσοστό γονιμοποίησης 92±8% σε 11±5 ωοτοκίες. Η αναπαραγωγή του είδους λοιπόν είναι εφικτή από τον Απρίλιο έως τον Ιούνιο αλλά μόνο με ορμονική θεραπεία παράγοντας γαμέτες σχετικά καλής ποιότητας.
(EL)
The target of the present study was the investigation of the reproductive cycle of
meagre (Argyrosomus regius) as well as the hormonal induction of reproduction using
implants of gonadotropin releasing-hormone agonist (GnRHa). For the study of the
reproduction cycle 7 samplings were performed within a period of 8 months. From
17/11/2009 until 15/3/2010 samplings were performed every 2 months and subsequently
(15/4/2010 – 16/7/2010) monthly. Thirteen fish were used (7 females, 6 males) with an
initial mean weight ± standard deviation 3,828±647 g, which originated from the HCMR
breeding unit in 2005. The stage of gametogenesis was examined during each sampling by
a gentle abdominal massage in males and by gonad biopsy in females. When males were
spermiating, the sperm was stored in ice and then with the use of an appropriate
methodology (Computer Assisted Aperm Analysis, CASA) the basic characteristics of
sperm quality were assessed (annex). In females the fresh sample was examined under an
optical microscope and part of the biopsy was stored in fixation solution in order to be
examined histologically. At the same time, a blood sample was collected in order to
estimate the quantity of steroidal hormones (ng ml-1), testosterone (T) and estradiol (E2) for
females, and testosterone and 11-ketotestosterone (11-KT) for males. The oocytes
presented a gradual increase in their diameter during the samplings and in June the
diameter reached its highest value (574±11.5 μm). On the contrary, a vertical reduction
was noted during July when the recorded diameter was similar to the one of November and
January (128±8.4 μm). Histologically, the gonads contained oocytes in several stages of
oogenesis driving to the conclusion that this species spawns more than once during its
reproductive period. The plasma analysis indicated that the maximum values for both
hormones in females were recorded in May (T=0.2 ng ml-1, E2=0.47 ng ml-1), a month
before the maximum diameter of oocytes. Subsequently, the levels of E2 seemed to return
to low levels similar to the previous months, while T presented a second peak in July
(T=0.16 ng ml-1). Males were spermiating from March to June and produced sperm of
constant density (26.8±7 x109 szoa ml-1) and motility (62±15%). The duration of sperm
mobility was also constant (1.2±0.5 min) and presented a maximum in April (1.94±1.5
min). The plasma analysis for the estimation of steroid hormones level in males indicated a
statistically significant change for both hormones in time. The maximum value for 11-KT
was recorded in March (0.818 ng/ml), whereas for T in July (0.295 ng ml-1). The lowest
values were recorded in November for both hormones. The starting month of spermiation coincides with the maximum of 11-KT, while the maximum of T coincides with the last month of spermiation.
Experiments were performed for the study of the hormonal induction of
reproduction during two successive years (2009-2010). In 2009 during a period of 45 days
three experiments of group induction of spawning were performed. In total 26 fish were
examined (12 females, 14 males) from which 23 (11 females, 12 males) received hormonal
treatment. The fish were placed in three tanks at 5/5/2009 (3 females, 3 males), at
18/5/2009 (4 females, 5 males) and at 9/6/2009 (4 females, 4 males) and they had an initial
mean body weight of 6,934±1,949 g. After the biopsy examination of females under an
optical microscope and the spermiation examination in males, a GnRHa implant (430±150
mg) was administered and the fish were returned in the tank while the spawning was
expected. The first spawning took place two days after the administration of the implant in
all cases, while the mean annual relative fecundity was estimated at 364,993 eggs kg-1 and
the percentage of fertilization at 85±2%. The male individuals which received hormonal
therapy produced sperm with a density of 14±5.3 x109 szoa ml-1. The sperm motility was
estimated at 78±7% and the duration of mobility at 1.8±0.1 min. The relative fecundity and
fertilization for females and density and motility for males were not statistically
significantly different (ANOVA, p≤0.05). The individual experiments on the hormonal
induction of reproduction were performed during the second year (2010). During two time
points, at 4/5/2010 and at 3/6/2010, 3 females and 6 males of initial mean weight
8,238±2,190 g were placed in 3 tanks at a 1:2 ratio following the above process of control
and administration of implants. The first spawning took place two days after the
administration of the implant, while the mean annual relative fecundity estimated at
434,860 eggs kg-1, the mean percentage of fertilization was 92±8% and the number of
spawnings recorded was 11±5. After the first spawn the spawning continued for at least 5
days, and after a 2-day cease at the maximum, the spawning continued. Fecundity
presented a maximum during the first four spawnings and was then gradually reduced until
the end of the spawnings. In the opposite case, the percentage of fertilization remains
constantly above 57% and in some cases reached 100%. There was no statistically
significant difference regarding fecundity and percentage of fertilization either between
individuals or between two different points in time (ANOVA, p≤0.05).
14
In conclusion, the meagre seems to reproduce successfully from April to June,
whereas males produce sperm at the same months. Equally positive results were recorded
after the trial of hormonal induction of reproduction both in May and June and the
production of eggs was estimated at 40,768±36,911 eggs kg-1 spawning-1 with a percentage
of fertilization at 92±8% within 11±5 spawnings. The reproduction of the meager was
possible from April to June but only with hormonal manipulation producing high quality
gametes.
(EN)
