Υπόβαθρο: Το οστεοσάρκωμα είναι ο πιο συχνός κακοήθης όγκος των οστών στα
παιδιά και τους εφήβους, με συχνότητα 4,4/1000000. Παρά την σημαντική αύξηση
του ποσοστού επιβίωσης των ασθενών με οστεοσάρκωμα τις τελευταίες δεκαετίες,
γεγονός που οφείλεται στην έγκαιρη διάγνωση και την χρήση της χημειοθεραπείας, η
κυτταρική παθοφυσιολογία του όγκου παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστη και η
παρουσία μεταστάσεων εξακολουθεί να αποτελεί ένα σημαντικότατο αρνητικό
προγνωστικό παράγοντα.
Σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και την εξέλιξη των όγκων έχουν οι σύνθετες
αλληλεπιδράσεις μεταξύ των καρκινικών κυττάρων, του εξωκυτταρίου χώρου (ECM)
και των γειτονικών φυσιολογικών κυττάρων. Η σύσταση της ECM επηρεάζει
σημαντικές λειτουργίες των φυσιολογικών και των καρκινικών κυττάρων, όπως ο
πολλαπλασιασμός, η προσκόλληση, η μετανάστευση και η διαφοροποίηση. Ένα από
τα κύρια συστατικά του εξωκυττάριου χώρου και της κυτταρικής μεμβράνης είναι οι
πρωτεογλυκάνες (PGs), οι οποίες μέσω του πρωτεϊνικού τους κορμού ή διαμέσου των
γλυκοζαμινογλυκανικών (GAGs) τους αλυσίδων, είναι ικανές να αλληλεπιδρούν με
μακρομόρια του εξωκυττάριου χώρου, όπως το κολλαγόνο, οι αυξητικοί παράγοντες,
οι υποδοχείς των αυξητικών παραγόντων και τα μόρια προσκόλλησης,
συμμετέχοντας με τον τρόπο αυτό στη ρύθμιση των κυτταρικών λειτουργιών.
Η παραθυρεοειδής ορμόνη είτε ως μια ενδογενώς παραγόμενη ορμόνη είτε ως
ένας εξωγενώς χορηγούμενος αντιοστεοπορωτικός παράγοντας διαδραματίζει
κομβικό ρόλο στην φυσιολογία του οστού. Ωστόσο παραμένει εν πολλοίς άγνωστη η
σημασία της δράσης της σε πρωτογενής όγκους των οστών όπως το οστεοσάρκωμα
Σκοπός: η μελέτη της επίδρασης τμημάτων της παραθυρεοειδούς ορμόνης στην
μετανάστευση κυτταρικών σειρών οστεοσαρκώματος ανθρώπου καθώς και ο
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.
προσδιορισμός των αλλαγών εκείνων του εξωκυτταρίου χώρου που επάγονται από
αυτήν και μεταβάλουν την μεταναστευτική ικανότητα αυτών των κυττάρων. Επίσης η
διερεύνηση των πιθανών εξωκυττάριων και ενδοκυττάριων μονοπατιών
σηματοδότησης που επιδρούν στη ρύθμιση της συγκεκριμένης κυτταρικής
λειτουργίας
Αποτελέσματα: Στα πλαίσια της παρούσας έρευνας μελετήθηκε εάν οι αλλαγές του
μεταβολισμού του υαλουρονικού (ΗΑ) που επάγονται από τα πεπτίδια ΡΤΗ ( 1-34)
και ΡΤΗ (7-84) της παραθορμόνης, σε μετρίως (MG63) και καλά διαφοροποιημένες
(Saos 2) κυτταρικές σειρές οστεοσαρκώματος, συσχετίζονται με την μεταναστευτική
ικανότητα των κυττάρων αυτών. Τα αποτελέσματά μας αποδεικνύουν ότι η
διαλείπουσα χορήγηση ΡΤΗ (1-34) οδήγησε σε σημαντική αύξηση (Ρ≤0,01 ) της
μετανάστευσης των κυττάρων MG63, αύξηση της έκφρασης της συνθάσης του ΗΑ,
ΗΑS-2 (Ρ ≤0,001) και στην ενισχυμένη εναπόθεση υψηλού μοριακού βάρους ΗΑ
στον περικυττάριο χώρο. Τόσο η αύξηση της ενδογενούς παραγωγής ΗΑ (Ρ ≤0,01)
όσο και η εξωγενής χορήγηση υψηλού μοριακού βάρους ΗΑ βρέθηκαν να
συσχετίζονται (Ρ ≤0,05) με μία σημαντική αύξηση της μεταναστευτικής ικανότητας
της κυτταρικής σειράς MG63. Επιμόλυνση με siHAS2 έδειξε ότι η ΡΤΗ (1-34),
κυρίως μέσω της HAS2, ενισχύει την παραγωγή του ΗΑ και ρυθμίζει την κυτταρική
κινητικότητα των MG63 κυττάρων. Είναι ενδιαφέρον ότι, η συνεχής χορήγηση ΡΤΗ
(1-34) διεγείρει στα Saos 2 κυττάρα την έκφραση της HAS2 (Ρ ≤0,001) και της HAS1
(Ρ ≤ 0,001 ) ισομορφής, ενώ αναστέλλει την έκφραση της υαλουρονιδάσης-2
(HYAL2) (Ρ ≤0,001) και ενισχύει μέτρια τη μετανάστευσή τους (Ρ ≤ 0,05). Ως εκ
τούτου, η ΡΤΗ (1-34) κατά τρόπο που εξαρτάται από την μέθοδο χορήγησης της
φαίνεται να ρυθμίζει σημαντικά την μεταναστευτική ικανότητα των MG63 και Saos2
κυτταρικών σειρών οστεοσαρκώματος. Συμπερασματικά, τα δεδομένα που
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.
προκύπτουν αναδεικνύουν την ύπαρξη μιας ρυθμιστικής επίδρασης της ΡΤΗ (1-34),
κατά ένα χρονικά εξαρτώμενο τρόπο χορήγησης, στον μεταβολισμό του ΗΑ γεγονός
που οδηγεί σε μεταβολές στη μετανάστευση των κυττάρων οστεοσαρκώματος.
Κατόπιν θελήσαμε να ερευνήσουμε την συμμετοχή και άλλων πιθανών μονοπατιών
διαμέσου των οποίων η ΡΤΗ (1-34) ρυθμίζει την μεταναστευτική ικανότητα των
κυττάρων του οστεοσαρκώματος προξενώντας μεταβολές στην σύνθεση του
εξωκυτταρίου και περικυτταρίου χώρου. Έτσι, ερευνήσαμε την πιθανή συμμετοχή
της σηματοδότησης του FGF2 (αυξητικός παράγοντας ινοβλαστών 2) στην ΡΤΗ (1-
34)-εξαρτώμενη κυτταρική μετανάστευση του οστεοσαρκώματος. Η χορήγηση FGF2
σε κύτταρα οστεοσαρκώματος οδήγησε σε σημαντική αύξηση (P ≤ 0,01) της
κυτταρικής μετανάστευσης των MG63, παρόμοια με εκείνη που προκαλείται από την
ΡΤΗ (1-34). Η mRNA ανάλυση της έκφρασης των κυττάρων στα οποία χορηγήθηκε
ΡΤΗ (1-34) έδειξε μία έντονη αύξηση του FGF2, σε επίπεδο μεταγραφής (Ρ =
0,0015). Είναι ενδιαφέρον ότι η προσθήκη του FGF2 σε κύτταρα MG63 οδήγησε σε
σημαντική καταστολή της έκφρασης της διγλυκάνης, μιας μικρής πλούσιας σε
λευκίνη πρωτεογλυκάνης, τόσο σε επίπεδο mRNA (P ≤ 0,0001) όσο και σε επίπεδο
πρωτεΐνης (60%). Προκειμένου να εξεταστεί η σημασία της διγλυκάνης στην
κυτταρική μετανάστευση των MG63 κυττάρων πραγματοποιήθηκε επιμόλυνση με
siRNA ειδικών για την διγλυκάνη, με αποτέλεσμα τη σημαντική αύξηση (P ≤ 0,01)
στην ικανότητα μετανάστευσης των κύτταρων αυτών. Σε αντίθεση, η εξωγενής
χορήγηση ανθρώπινης ανασυνδυασμένης διγλυκάνης ανέστειλε έντονα την
μετανάστευση αυτών των κυττάρων (P ≤ 0,01). Τέλος, διαπιστώθηκε μια
άμεση
συσχέτιση μεταξύ της δράσης της PTH (1-34) και της έκφρασης της διγλυκάνης με
σημαντική μείωση (P ≤ 0,01) σε επίπεδο μεταγραφής της διγλυκάνης στα κύτταρα
στα οποία χορηγήθηκε PTH (1-34). Συνοπτικά, η παρούσα μελέτη αποδεικνύει ένα
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.
νέο συνεργικό μηχανισμό δράσης της ΡΤΗ (1-34) με τον FGF2 που οδηγεί σε
μεταβολές της παρουσίας της διγλυκάνης στον εξωκυττάριο χώρο, οι οποίες με την
σειρά τους προξενούν μεταβολές στη ρύθμιση της κυτταρικής μετανάστευσης του
οστεοσαρκώματος. Λαμβάνοντας υπόψην τη σημασία του TGFβ στα οστά καθώς και
την ρυθμιστική επίδραση που έχει η διγλυκάνη σε αυτόν και προκειμένου να
διαπιστωθεί η αναγκαιότητα του TGFβ για τη μετανάστευση των κυττάρων του
οστεοσαρκώματος δημιουργήθηκαν κύτταρα MG63 ελλιπή σε διγλυκάνη στα οποία
προστέθηκε αντίσωμα έναντι του TGFβ. Διαπιστώθηκε ότι ενώ τα κύτταρα που ήταν
ελλιπή σε διγλυκάνη παρουσίασαν αύξηση της μεταναστευτικής δραστηριότητας
τους (Ρ<0.01), τα ελλιπή σε διγλυκάνη κύτταρα στα οποία είχε επίσης προστεθεί το
αντίσωμα anti-TGFβ1 δεν κατόρθωσαν να αυξήσουν την μεταναστευτική
δραστηριότητά τους γεγονός που καταδυκνύει την σημασία του TGFβ1 στην
μεταναστευτική ικανότητα τους. Λαμβάνοντας υπόψην την σημασία που έχει η
συνδεκάνη 4 στην βιολογία διαφορετικών καρκινικών κυττάρων καθώς και την
σημασία του συμπλόκου FGFR/συνδεκάνη 4 στην επίτευξη αυτού του ρόλου
θελήσαμε να διαπιστώσουμε την σημασία της συνδεκάνη 4 στην μετανάστευση των
κυττάρων οστεοσαρκώματος ΜG63. Έτσι προχωρήσαμε στην δημιουργία κυττάρων
MG63 ανεπαρκών σε συνδεκάνη 4 (siSynd4) στα οποία χορηγήσαμε FGF2 και
διαπιστώσαμε οτι αυτά δεν παρουσίασαν την αναμενόμενη αύξηση στην ικανότητα
τους να μεταναστεύουν.Κατα αυτόν τον τρόπο δείξαμε οτι η συνδεκάνη 4 αποτελεί
ένα απαραίτητο μόριο στο μηχανισμό με τον οποίο ο FGF-2 επιτυγχάνει την αύξηση
της κυτταρικής μετανάστευσης των MG63 κυττάρων.
Συμπεράσματα: Mε την παρούσα μελέτη διαπιστώθηκαν 2 πιθανοί μηχανισμοί
διαμέσου των οποίων η ΡΤΗ (1-34) επιτυγχάνει τη δράση της στη μεταναστευτική
ικανότητα των κυττάρων του οστεοσαρκώματος.
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.
1ος Μηχανισμος: Η ΡΤΗ (1-34) ελέγχοντας τον μεταβολισμό του υαλουρονικού
οξέος (ΗΑ) αυξάνει τη μεταναστευτική ικανότητα των κυττάρων του
οστεοσαρκώματος.
2ος Μηχανισμός: Η ΡΤΗ (1-34) ελέγχοντας την σύνθεση της διγλυκάνης με τη
διαμεσολάβηση του FGF-2 κατορθώνει να μεταβάλλει τη μεταναστευτική ικανότητα
των κυττάρων του οστεοσαρκώματος. Σε αυτή τη δράση του FGF-2 κρίσιμο ρόλο
έχει η συνδεκάνη 4.
(EL)
Backround: Osteosarcoma is the most common malignant bone tumor in children
and adolescents, with frequency 4,4 / 1000000. Despite the significant increase in the
survival rate of patients with osteosarcoma over the past decades, due to early
diagnosis and the use of chemotherapy, the tumor cell pathophysiology remains
largely unknown and the presence of metastases continues to be a major negative
prognostic factor.
Complex interactions between cancer cells, the extracellular matrix (ECM) and the
adjacent normal cells play an important role in development and tumor progression
.ECM composition affects important functions of normal and tumor cells, such as
proliferation, adhesion, migration and differentiation. One of the main components of
the extracellular matrix and cell membrane are proteoglycans (PGs), through which
their protein core or through their glycosaminoglycans (GAGs) chains are capable
to interact with macromolecules of the extracellular matrix such as collagen, growth
factors, growth factor receptors and adhesion molecules , participating in this way to
the regulation of various cellular functions.
Parathyroid hormone (PTH) as either an endogenous produced hormone or an
administered antiosteoporotic factor plays a key role in the physiology of
bone. However it remains largely unknown the importance of PTH action in primary
bone tumors such as osteosarcoma
Aim: To study the effect of different parathyroid hormone peptides in the migration of
human osteosarcoma cell lines and to identify possible changes of the extracellular
matrix induced by PTH peptides that affect the migratory capacity of these cells.
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.
Moreover, the investigation of potential extracellular and intracellular signaling
pathways that may regulate this specific cellular function
Results: we investigated whether the changes of HA metabolism induced by PTH (1–
34) and PTH (7–84) peptides in moderately MG-63 and well-differentiated Saos 2
osteosarcoma cell lines, are correlated to their migration capabilities. Our results
demonstrate that intermittent PTH (1–34) treatment significantly (P ≤ 0.01) supported
the migration of MG-63 cells, increased their HA-synthase-2 (HAS2) expression (P
≤0.001), and enhanced their high-molecular size HA deposition in the pericellular
matrix. Both increased endogenous HA production (P ≤ 0.01) and treatment with
exogenous high-molecular weight HA (P ≤ 0.05) correlated to a significant increase
of MG-63 cell migration capacity. Transfection with siHAS2 showed that PTH (1–
34), mainly through HAS2, enhanced HA and regulated MG-63 cell motility.
Interestingly, continuous PTH (1–34) treatment stimulated both Saos 2 cell HAS2 (P
≤0.001) and HAS1 (P ≤ 0.001) isoform expression inhibited their HYAL2 expression
(P ≤ 0.001) and modestly (P ≤ 0.05) enhanced their migration. Therefore, the PTH (1–
34) administration mode appears to distinctly modulate the migratory responses of the
MG-63 moderately and Saos 2 well-differentiated osteosarcoma cell lines.
Conclusively, the obtained data suggest that there is a regulatory effect of PTH (1–
34), in an administration mode-dependent manner, on HA metabolism that is essential
for osteosarcoma cell migration. Then we wanted to investigate the participation of
other potential pathways through which PTH(1-34) regulates the migratory capacity
of osteosarcoma cells, through regulation of the composition of the extracellular and
pericellular space. Thus, we investigated the possible participation of FGF-2 signaling
in PTH(1–34)-dependent osteosarcoma cell migration. FGF-2 treatment of
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.
osteosarcoma cells resulted in a significant increase (P ≤ 0.01) in MG63 cell
migration, similar to that caused by PTH(1–34). mRNA expression analysis of cells
treated with PTH(1–34) showed a strong increase in FGF-2 transcript levels (P =
0.0015). Interestingly, the addition of FGF-2 to MG63 cells led to significant
downregulation of small leucine-rich proteoglycan biglycan expression at both the
mRNA (P ≤ 0.0001) and protein (60%) levels. In order to examine the significance of
biglycan on MG63 cell migration, transfection with short interfering RNA specific for
biglycan was performed, resulting in a significant increase (P ≤ 0.01) in the migration
capacity of biglycan-deficient MG63 cells. In contrast, exogenous human
recombinant biglycan strongly inhibited the migration of these cells (P ≤ 0.01).
Finally, a direct correlation between PTH(1–34) action and biglycan expression was
established by the finding of a significant decrease (P ≤ 0.01) in biglycan transcript
levels in PTH(1–34)-treated cells. To summarize, the present study demonstrates a
novel cooperative mechanism of PTH(1–34) and FGF-2 action that results in specific
alteration of the biglycan extracellular matrix content to regulate osteosarcoma cell
migration.. Taking into consideration the importance of TGFb in bone biology and the
regulatory effect of the biglycan on TGFb action, in order to determine the necessity
of TGF b for cell migration we created MG 63 biglycan-deficient osteosarcoma cells.
We treated these cells with an antibody against TGFb and we found that while
biglycan-deficient cells increased their migration capacity (P <0.01), biglycandeficient
cells which were treated with the anti - TGFb1 antibody failed to increase
their migration activity. These results show the importance of TGFb1 in migration
capacity of MG63 cells .It has been shown that syndecan 4 plays an important role in
the biology of different tumor cells and that this role is achieved through complex
FGFR / syndecan 4 interactions. We sought to determine the importance of syndecan
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.
4 in MG63 osteosarcoma cell migration. We proceeded to create MG 63 cells
deficient in syndecan 4 (siSynd 4) in which we administered FGF 2 and found that
they did not show the expected increase in their ability to migrate. Thereby shown
that syndecan 4 is an essential molecule in the mechanism in which the FGF -2
achieves increased cell migration of MG 63 cells.
Conclusions: With this study we identified two possible pathways through which
PTH (1-34) achieves its action on migration ability of osteosarcoma cells.
1st Pathway: PTH (1-34) controlling the metabolism of hyaluronic acid (HA)
increases the migratory ability of osteosarcoma cells.
2nd Pathway: PTH (1-34) controlling the synthesis of biglycan through regulation of
FGF2 expression, manages to alter migration ability of osteosarcoma cells. Syndecan4
is an essential component for the action of FGF2 in this pathway.
(EN)
