Το κακόηθες μελάνωμα έχει προσελκύσει το πραγματικό ενδιαφέρον τα τελευταία χρόνια λόγω της αυξημένης συχνότητάς του. Η συχνότητα εμφάνισής του έχει εκτιμηθεί ότι διπλασιάζεται παγκοσμίως κάθε 10-15 χρόνια και ο κίνδυνος στη διάρκεια της ζωής είναι μεταξύ 0,5-1,0 %. Προσβάλλει κυρίως ανθρώπους με λευκό δέρμα και η έκθεση στην υπεριώδη ακτινοβολία είναι ένας ουσιαστικός παράγοντας για την ανάπτυξή του, η δε σχέση μεταξύ κινδύνου και έκθεσης είναι ασαφής. Το κακόηθες μελάνωμα είναι η πιο σοβαρή δερματική κακοήθεια και η πρόγνωση μερικών όγκων παραμένει πολύ πτωχή. Το πάχος κατά Breslow, δηλαδή το κατακόρυφο πάχος του όγκου από την κοκκώδη στιβάδα της επιδερμίδας στη βαθύτερη περιοχή του μελανώματος, είναι ο πιο σημαντικός προγνωστικός παράγον. Γενικά, οι ασθενείς με λεπτούς όγκους έχουν πολύ μεγαλύτερη επιβίωση από εκείνους με παχύς βλάβες, το δε ποσοστό της 5ετούς επιβίωσης για αλλοιώσεις μικρότερες από 1,5 mm πάχους είναι 93 %, συγκρινόμενο με το 73% για εκείνες με 1,5-3, 49 mm πάχους, και το 48 % για εκείνες των 3,5 mm ή και περισσότερο.
Οι πρωτεογλυκάνες (proteoglycans, PGs) είναι μια από τις κύριες κατηγορίες γλυκοσυζευγμάτων (glycoconjugates) που συναντώνται σε όλους τους ιστούς. Εντοπίζονται κυρίως στον εξωκυττάριο χώρο, αλλά και σε κυτταρικό επίπεδο (μεμβράνη και εκκριτικά ενδοκυτταρικά κοκκία). Συμμετέχουν στη ρύθμιση σημαντικών κυτταρικών γεγονότων όπως, κυτταρική προσκόλληση, μετακίνηση, διαφοροποίηση και πολλαπλασιασμός. Συμμετέχουν επίσης στην οργάνωση του εξωκυττάριου χώρου μέσω των αλληλεπιδράσεών τους με σημαντικά μακρομόρια όπως το κολλαγόνο, οι λιποπρωτεΐνες, οι αυξητικοί παράγοντες και οι υποδοχείς αυξητικών παραγόντων. Οι PGs αποτελούνται από έναν πρωτεϊνικό κορμό πάνω στον οποίο συνδέονται ομοιοπολικά αλυσίδες γλυκοζαμινογλυκανών (glycosaminoglycans, GAGs) και ολιγοσακχαριτών. Τόσο ο πρωτεϊνικός κορμός όσο και οι υδατανθρακικές αλυσίδες προσδίδουν στις πρωτεογλυκάνες μοναδικές βιολογικές και φυσικοχημικές ιδιότητες.
Η τάση του φυσιολογικού δέρματος προς διατήρηση της σταθερότητας των στοιχείων του υποστηρίζεται από τη δυναμική αλληλεπίδραση μεταξύ των μελανοκυττάρων και του μικροπεριβάλλοντός τους όπως είναι τα κερατινοκύτταρα, οι ινοβλάστες, τα κύτταρα του ανοσολογικού συστήματος και η εξωκυττάριος 1
θεμέλια ουσία. Τα μελανοκύτταρα προσφύονται στα κερατινοκύτταρα ενώ η επικοινωνία μεταξύ μελανοκυττάρων και ινοβλαστών ή ενδοθηλιακών κυττάρων πραγματοποιείται μέσω διαλυτών παραγόντων. Στην πορεία του μετασχηματισμού και της εξέλιξης των μελανοκυττάρων και των κυττάρων του μελανώματος, υπάρχουν αλληλεπιδράσεις μεταξύ των νεοπλασματικών κυττάρων και των παρακείμενων φυσιολογικών κυττάρων του δέρματος, όπως είναι τα κύτταρα της δερμίδας και τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Αυτοκρινείς αυξητικοί παράγοντες όπως ο bFGF που παράγεται από τα κύτταρα του μελανώματος διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των ίδιων των αρχέγονων κυττάρων και παρακρινείς αυξητικοί παράγοντες όπως ο PDGF και ο VEGF ρυθμίζουν το μικροπεριβάλλον προάγοντας την ανάπτυξη του όγκου και την διήθηση. Οι παρακρινικές επιδράσεις περιλαμβάνουν τον πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών και την ινοπλασία (δεσμοπλασία), την αγγειογέννεση και την φλεγμονή. Έχει αναφερθεί ότι η παραγωγή αυξητικών παραγόντων από τα κύτταρα του μελανώματος είναι η κινητήριος δύναμη για την εξέλιξη του ακτινωτού (RGP) σε κατακόρυφο (VGP) μελάνωμα διότι ελέγχουν εκτός από την ανάπτυξη του όγκου και τον σχηματισμό του στρώματος.
Η ανάπτυξη του καρκίνου ως εξέλιξη με πολλά βήματα χρειάζεται μεταξύ των άλλων και επιπλέον μελέτες για τον χαρακτηρισμό της ανάμειξης των διαφόρων πρωτεογλυκανών σε κάθε βήμα των νεοπλασιών. Καθορισμός του ρόλου της κάθε πρωτεογλυκάνης και ξεχωριστά των εκκρινόμενων ή/και των συνδεδεμένων με την κυτταρική μεμβράνη πρωτεογλυκανών στους παθολογικούς μηχανισμούς. Η πληρέστερη ανάλυση της δομής των γλυκοζαμινογλυκανικών αλυσίδων πρέπει επίσης να συσχετίζεται με την παθολογική ανατομική. Πιστεύεται, ότι η γνώση της δομής και του ρόλου ειδικών πρωτεογλυκανών θα προσφέρει μηχανισμούς δράσης που θα βοηθήσουν την θεραπεία του καρκίνου.
Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη της δράσης των αυξητικών παραγόντων στην έκφραση των πρωτεογλυκανών και γλυκοζαμινογλυκανών σε κυτταρικές σειρές ανθρώπινου μελανώματος και σε φυσιολογικά μελανοκύτταρα. Πιο συγκεκριμένα, μελετήθηκε η έκφραση της λουμικάνης, που ανήκει στην κατηγορία των μικρών πλούσιων σε λευκίνη προτεογλυκανών (SLRPs), σε κύτταρα του μελανώματος και σε μελανοκύτταρα. Επιπλέον, εξετάστηκε ο ρόλος διαφορετικών γλυκοζαμινογλυκανών (όπως η θειική χονδροϊτίνη/δερματάνη και η ηπαρίνη) στο βασικό και στον επαγόμενο από τον FGF-2 πολλαπλασιασμό των κυττάρων του 2
μελανώματος. Τέλος, μελετήθηκε η επίδραση της συνδεκάνης-4 στην επαγόμενη από τον FGF-2 μετανάστευση και προσκόλληση των κυττάρων του μελανώματος μέσω του σηματοδοτικού κυτταρικού μονοπατιού της FAK.
Οι μικρές πλούσιες σε λευκίνη πρωτεογλυκάνες αποτελούν σημαντικά συστατικά του εξωκυττάριου χώρου που συμμετέχουν στη δομική και λειτουργική οργάνωση του δέρματος. Πρόσφατα έχει βρεθεί ότι η λουμικάνη συμμετέχει σε μηχανικές λειτουργίες του δέρματος και η μείωση της έκφρασής της συνδέεται με μείωση της ελαστικότητας και ανθεκτικότητας του δέρματος. Ο ρόλος της λουμικάνης έχει ήδη διερευνηθεί στην ανάπτυξη και μετάσταση διαφόρων καρκίνων χωρίς όμως να έχει πλήρως διαλευκανθεί. Συγκεκριμένα έχουν βρεθεί αυξημένα επίπεδα λουμικάνης (mRNA) και διαφόρων γλυκοζυλιομένων τύπων της πρωτεΐνης σε καρκίνο παχέως εντέρου, ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα και σε αδενοκαρκίνωμα παγκρέατος. Αντίθετα στον καρκίνο του μαστού η λουμικάνη εκφράζεται στους ινοβλάστες που είναι κοντά στα καρκινικά κύτταρα αλλά όχι στα ίδια τα καρκινικά κύτταρα. Επίσης έχει βρεθεί ότι η μείωση της έκφρασης της λουμικάνης σχετίζεται με τη φτωχή πρόγνωση στο (node negative) διηθητικό καρκίνο μαστού ενώ υψηλά επίπεδα έκφρασης σχετίζονται με υψηλό βαθμό κακοήθειας, χαμηλά επίπεδα οιστρογονικών υποδοχέων στον καρκινικό ιστό καθώς και με την νεαρή ηλικία των ασθενών. Επίσης υψηλά επίπεδα έκφρασης λουμικάνης έχουν βρεθεί στο στρώμα μυοϊνοβλαστών σε όγκο παγκρέατος.
Στη παρούσα διατριβή μελετήθηκε η έκφραση της λουμικάνης σε δύο κυτταρικές σειρές ανθρώπινου μεταστατικού μελανώματος (WM9 & M5) καθώς και σε φυσιολογικά μελανοκύτταρα με τη χρήση αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (Real-Time PCR) και στύπωμα κατά Western. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι και στις δύο κυτταρικές σειρές μελανώματος εκφράζεται η λουμικάνη τόσο σε μεταγραφικά επίπεδα (mRNA) όσο και σε πρωτεϊνικά επίπεδα σε μορφή γλυκοζιλιωμένης πρωτεογλυκάνης κυρίως με αλυσίδες θειïκής κερατάνης. Αντίθετα, η λουμικάνη δεν ανιχνεύτηκε στα φυσιολογικά μελανοκύτταρα.
Ο βασικός παράγοντας ανάπτυξης των ινοβλαστών 2 (FGF-2) και οι αντίστοιχοι υποδοχείς της κινάσης της τυροσίνης σχηματίζουν ένα αυτοκρινές σύμπλεγμα που επηρεάζει την ανάπτυξη και την μετάσταση του ανθρώπινου μελανώματος. Ο επόμενος σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν να εξετάσει την πιθανή συμμετοχή διαφόρων γλυκοζαμινογλυκανών όπως η θειïκή χονδροïτίνη, θειïκή δερματάνη και ηπαρίνη στη βασική και στην επαγόμενη ανάπτυξη από τον 3
FGF-2 των δυο κυτταρικών σειρών WM9 και Μ5 ανθρώπινου μεταστατικού μελανώματος. Εξωγενώς προστιθέμενες γλυκοζαμινογλυκάνες αναστέλλουν ελαφρώς τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων WM9 που είχε κατασταλεί από τον FGF-2. Η χορήγηση χλωριούχου νατρίου, ειδικό αναστολέα της θείωσης των γλυκοζαμινογλυκανών, απέδειξε ότι οι ενδογενώς παραγόμενες γλυκοζαμινογλυκάνες και πρωτεογλυκάνες είναι αναγκαίες τόσο για τον βασικό όσο και για τον επαγόμενο από τον FGF-2 πολλαπλασιασμό αυτών των κυττάρων. Η ηπαρίνη επαναφέρει τον ρυθμό ανάπτυξης των WM9 και Μ5 κυττάρων. Η εξωγενής χορήγηση θειïκής χονδροïτίνης αυξάνει τον επαγόμενο από τον FGF-2 πολλαπλασιασμό των δύο κυτταρικών σειρών του μελανώματος, ενώ η θειïκή δερματάνη επάγει τη μιτογονική δράση του FGF-2 μόνο στα Μ5 κύτταρα. Επιπλέον η αποδόμιση των μεμβρανικών πρωτεογλυκανών θειïκής χονδροïτίνης και δερματάνης στα WM9 κύτταρα διέγειρε τη βασική ανάπτυξη και αύξησε περισσότερο την διέγερση του FGF-2. Η γενιστεïνη, ειδικός αναστολέας της κινάσης της τυροσίνης, εμπόδισε πλήρως τη δράση του FGF-2 και των γλυκοζαμινογλυκανών στον πολλαπλασιασμό του μελανώματος, ενώ η χρήση ειδικού αντισώματος για τον FGF-2 έδειξε ότι η μιτογονική δράση της θειïκής χονδροïτίνης περιλαμβάνει την αλληλεπίδραση του FGF-2 με τους υποδοχείς του. Οι ποσότητες των γλυκοζαμινογλυκανών θειïκής χονδροïτίνης, δερματάνης και ηπαράνης καθώς και τα επίπεδα θείωσής τους διαφέρουν μεταξύ των κυτταρικών σειρών και ρυθμίζονται ευκρινώς από τον FGF-2. Στην παρούσα μελέτη δείχνουμε ότι οι πρωτεογλυκάνες που περιέχουν θειïκή χονδροïτίνη και δερματάνη, πιθανό σε συνεργασία με την θειïκή ηπαράνη, συμμετέχουν στη μιτογονική δράση του FGF-2 που παρατηρείται στα μεταστατικά κύτταρα μελανώματος. Τα αποτελέσματά μας αποτελούν νέα ευρήματα και τεκμηριώνουν τον κεντρικό και σημαντικό ρόλο των γλυκοζαμινογλυκανών στην ανάπτυξη του μελανώματος.
Ο αυξητικός παράγοντας FGF-2 έχει δειχθεί βιβλιογραφικά να παίζει σημαντικό ρυθμιστικό ρόλο στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, μετανάστευση και διαφοροποίηση. Στην συνέχεια η παρούσα μελέτη απέδειξε ότι η μεταναστευτική ικανότητα, στα κύτταρα Μ5 από ανθρώπινο μεταστατικό μελάνωμα, αυξάνεται σημαντικά από την εξωγενή προσθήκη FGF-2 ενώ η εξουδετέρωση του ενδογενούς FGF-2 διεγείρει την προσκόλλησή τους. Έχει ήδη βρεθεί ότι ο FGF-2 ρυθμίζει τη σύνθεση των ιδιαίτερων υποομάδων γλυκοζαμινογλυκανών/πρωτεογλυκανών (GAGs/PGs) αλλάζοντας την ποσότητα και την κατανομή τους στα Μ5 κύτταρα. Στη μελέτη μας η χορήγηση του FGF-2 μειώνει σημαντικά τα επίπεδα της έκφρασης της 4
5
συνδεκάνης-4 (πρωτεογλυκάνης που περιέχει αλυσίδες θειïκής ηπαράνης). Η συνδεκάνη-4 αποτελεί ρυθμιστικό συστατικό προσκόλλησης σε ποικιλία κυτταρικών τύπων και προσκολλάται σε διαφορετικά μόρια του μικροπεριβάλλοντος της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας που περιλαμβάνουν την ινονεκτίνη (FN). H μείωση της έκφρασης της συνδεκάνης-4 με τη χρήση ειδικού siRNA αυξάνει την κινητικότητα των κυττάρων του μελανώματος και μειώνει την πρόσδεσή τους στην ινονεκτίνη, αποδεικνύοντας το ρυθμιστικό ρόλο της συνδεκάνης-4 σε αυτές τις κυτταρικές λειτουργίες. Είναι γνωστό ότι η συνδεκάνη-4 ρυθμίζει τη φωσφορυλίωση της FAK. Στην παρούσα μελέτη φάνηκε ότι ο FGF-2 αναστέλλει τη φωσφορυλίωση της FAK Υ397 κατά τη διάρκεια της προσκόλλησης των Μ5 κυττάρων σε υπόστρωμα ινονεκτίνης, προάγοντας τη μετανάστευσή τους. Η παρατηρούμενη μείωση της δράσης της FAK Υ397 σχετίστηκε με τα επίπεδα έκφρασης της συνδεκάνης-4. Επομένως, η μεταναστευτική ικανότητα των Μ5 κυττάρων ρυθμίζεται από τη δράση του FGF-2 μέσω της επίδρασής του στην έκφραση της συνδεκάνης-4.
Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής έδειξαν το σημαντικό ρόλο των πρωτεογλυκανών και γλυκοζαμινογλυκανών στο βασικό και επαγόμενο από τον FGF-2 ρυθμό ανάπτυξης, προσκόλλησης και μετανάστευσης των κυττάρων του μελανώματος και των φυσιολογικών μελανοκυττάρων.
(EL)
Melanoma is a frequent and therapy resistant human malignancy with a rising incidence rate, worldwide (Houghton et al., 2002). Malignant melanoma arises in the epidermis either in situ or in an invasive form, progressing from radial growth phase to vertical growth phase through enhanced invasion into the dermis (Lever, 2005). With malignant progression tumor cells partly through autocrine and paracrine production of growth factors and cytokines actively modulate their microenvironment in a tumor-favourable way to enable successful invasion (Selvamurugan et al., 2002; Hakamori et al., 2002; Nikitovic et al., 2006). The dermis extracellular matrix (ECM) consists of different types of collagens, glycoproteins, hyaluronan (HA) and proteoglycans (PGs) (Wang et al., 2003).
Members of the small leucine-rich proteoglycans (SLRPs) family were found to participate in both the structural and the functional organization of the skin (Wang et al., 2003; Carrino et al., 2000). Previously it was shown that the SLRP lumican significantly affects the mechanical properties of the skin and that the lack of its expression results in skin fragility and laxity (Carrino et al., 2000; Vuillermoz et al., 2005). The role of lumican has been investigated in the growth and metastasis of several cancers, without being fully elucidated (Naito, 2005). Specifically it was demonstrated that human colorectal cancer cells (Lu et al., 2002), cervical squamous carcinoma cells (Naito, 2002) and pancreatic adenocarcinoma cells express lumican mRNA and different glycosylated types of its protein (Lu, 2002). In contrast, lumican in breast cancer tissues is expressed in fibroblasts adjacent to cancer cells but not in cancer cells (Leygue et al., 1998). Furthermore, it has been demonstrated that reduced expression of lumican is associated with poor outcome in node-negative invasive
6
breast cancer (Troup et al., 2003) while high expression level of lumican is associated with a high pathological tumor grade, low estrogen receptor levels in the cancer tissue, and younger age of patients (Leygue et al., 1998). Pancreatic myofibroblasts of the tumor stroma were also found to strongly overexpress lumican (Koninger et al., 2004). An in vitro/in vivo study showed that lumican expression by transfected B16F1 mouse melanoma cells resulted in inhibition of hypodermal melanoma growth in syngenic mice, but failed to change the B16F1 cell differentiation, growth rate and adhesion properties (Vuillermoz et al2004). The above reports suggest that lumican may have a role both in the host reaction of the peritumoral cells as well as in tumor growth. The expression of lumican by human melanoma cells has not, to our knowledge, been reported. The aim of the present study was to investigate and to characterize lumican expression at the mRNA, protein and carbohydrate level, in two human malignant melanoma cell lines (WM9 and M5) and normal neonatal human melanocytes (HEMN).
Both human metastatic melanoma cell lines were found to express lumican mRNA and effectively secrete lumican in a proteoglycan (PGs) form, characterized to be substituted mostly with keratan sulfate chains. Lumican mRNA was not detected in normal melanocytes. This is the first time that the synthesis and secretion of lumican in human melanoma cell lines is reported. The role of this proteoglycan in the development and progression of malignant melanoma has to be further investigated.
The members of the fibroblast growth factor (FGF) family (Eswarakumar, Lax, & Schlessinger, 2005) function through four distinct, high-affinity cell surface receptors with intrinsic tyrosine kinase activity, designated FGFR1–4 (Basilico & Moscatelli, 1992). The binding of FGFs to the extracellular ligand domain of FGFRs induces receptor dimerization, activation and autophosphorylation of multiple
7
tyrosine residues in the cytoplasmic domain of the receptor molecule (Jaye, Schlessinger, & Dionne, 1992), leading to the stimulation of intracellular signaling pathways that control cell proliferation, differentiation, migration or survival (Eswarakumar et al., 2005). Human melanomas most uniformly constitutively express basic fibroblast growth factor (FGF-2). As these cancer cells simultaneously express FGFRs their growth is stimulated by FGF-2 in an autocrine manner (Rodeck, 1993; Rodeck et al., 1991; Yeoman, 1993). The biological significance of this autocrine loop has been demonstrated using anti-sense oligonucleotides that targeted FGF-2 or by inactivating FGF-2 with anti-FGF-2 antibodies resulting in an inhibition of melanoma cell proliferation both in vitro and in vivo (Beckcer, Meier, & Herlyn 1989; Rofstad & Halsor, 2000; Wang & Becker, 1997). On the other hand, increased expression of FGF-2 stimulates the transformed melanoma phenotype demonstrating that FGF-2-dependent signaling is essential in melanoma tumor progression (Meier et al., 2000).
FGF-2 has a strong binding affinity for heparin/heparan sulfate glycosaminoglycans (GAGs) which when covalently bound in to core proteins form HS proteoglycans (HSPGs). Indeed, membrane HSPGs have been characterized as low-affinity binding sites for FGFs that do not transmit a biological signal but rather function as accessory molecules that regulate FGF binding and the activation of the occupied signaling receptors (Yayon, Klagsbrun, Esko, Leder, & Ornitz, 1991). Their removal from the cell surface impairs responsiveness to this growth factor (Rapraeger, Krugka, & Olwin, 1991; Yayon et al., 1991). In some cases extracellular HSPGs act as substitutes for their cell-associated counterparts and correctly present the bound FGF-2 to its respective receptors (Aviezer, Iozzo, Noonan, & Yayon, 1997; Delehedde, Deudon, Boilly, & Hondermarck, 1996). A rising amount of evidence has
8
lately implicated chondroitin sulfate-containing proteoglycans (CSPGs) to participate in FGF-2 signaling (Bao et al., 2004; Molteni, Modrowski, Hott, & Marie, 1999; Smith et al., 2007). CSPGs were shown to modulate the binding of FGF-2 to FGFRs, either autonomously in the role of low affinity binding sites (Smith et al., 2007) or in cooperation with HS chains (Deepa, Yamada, Zako, Goldberger, & Sugahara, 2004). Therefore, the content and the fine structure of both HS and CS chains might modulate FGF-2 binding and FGFRs activation in a cell type specific manner.
Differential expression of PGs on the surface of human melanoma cells is characterized by altered experimental metastatic potential thus demonstrating that GAGs/PGs participate in melanoma progression (Timar et al., 1995). Furthermore, both cell-associated and extracellular HSPGs were shown to alter melanoma cell FGF-2 signaling to increase melanoma metastatic potential (Delehedde et al., 1996; Reiland, Kempf, Roy, Denkins, & Marcheti, 2006). On the other hand, it is well known that FGF-2 may regulate the synthesis and distribution of GAGs/PGs by different cancer cell lines (Tzanakakis, Hjerpe, & Karamanos, 1997) and thus it may modulate the expression of GAGs/PGs in an autocrine manner in the human melanoma cell model.
The aim of the present study was to examine the possible participation of various glycosaminoglycans (GAGs), i.e. chondroitin sulfate, dermatan sulfate and heparin on basal and FGF-2-induced growth of WM9 and M5 human metastatic melanoma cells. Exogenous glycosaminoglycans mildly inhibited WM9 cell’s proliferation, which was abolished by FGF-2. Treatment with the specific inhibitor of the glycosaminoglycan sulfation, sodium chlorate, demonstrated that endogenous GAGs/PGs production is required for both basal and stimulated by FGF-2 proliferation of these cells. Heparin capably restored their growth, and unexpectedly
9
exogenous chondroitin sulfate to WM9 and both chondroitin sulfate and dermatan sulfate to M5 cells allowed FGF-2 mitogenic stimulation. Furthermore, in WM9 cells the degradation of membrane-bound chondroitin/dermatan sulfate stimulates basal growth and even enhances FGF-2 stimulation. The specific tyrosine kinase inhibitor,
genistein completely blocked the effects of FGF-2 and glycosaminoglycans on melanoma proliferation whereas the use of the neutralizing antibody for FGF-2 showed that the mitogenic effect of chondroitin sulfate involves the interaction of FGF-2 with its receptors. Both the amounts of chondroitin/dermatan/heparan sulfate and their sulfation levels differed between the cell lines and were distinctly modulated by FGF-2. In this study, we show that chondroitin/dermatan sulfate-containing proteoglycans, likely in cooperation with heparan sulfate, participate in metastatic melanoma cell FGF-2-induced mitogenic response, which represents a novel finding and establishes the central role of sulfated glycosaminoglycans on melanoma growth.
Furthermore, FGF-2-overexpressing melanocytes exhibit marked proliferation, upwards migration, cluster formation and type IV collagen expression within the epidermal compartment, stimulating early radial growth phase melanoma, demonstrating that FGF-2 signaling is essential in melanoma progression (Meier et al., 2003). The interactions between the extracellular matrix (ECM) and the cancer cells regulate their adhesive/migratory properties and thus define their invasive phenotypes (Cavallaro and Christofori, 2001). These adhesion-dependent signals are mediated by clustering of adhesion receptors such as integrins and cell surface proteoglycans (PGs), organization of the actin cytoskeleton, and congregation of signaling adaptors and enzymes into specialized morphological structures, including focal adhesions, focal complexes, and fibrillar adhesions (Yamada and Geiger, 1997). Importantly, changes in the expression or function of these adhesion molecules have
10
been documented in the progression of primary melanoma (Satyamoorthy and Herlyn, 2002).
Syndecan-4 is a member of a family of HS-containing transmembrane proteoglycans (syndecans 1–4), that are characterized by short cytoplasmic domains containing a variable region that is unique for each family member and divergent extracellular domains (Simons and Horowitz, 2001). This PG has been established as a key adhesion molecule, unique among the syndecan family members to localize to sites of cell-matrix adhesions, including focal adhesions (Woods and Couchman, 1994, 2001; Couchman and Woods, 1999; Petit and Thiery, 2000). The HS chains of
syndecan-4 specifically attach to the heparin-binding site of FN, affecting focal adhesion formation on this substrate, which in turn regulates cell migration (Midwood et al., 2006). FN, a high molecular weight multidomain glycoprotein of the ECM (Pankov and Yamada, 2002) which contains multiple binding sites including those for sulphated GAGs and cell surface integrin receptors, was chosen as the specific adhesion substrate. Expression of FN has been correlated to melanoma progression (Jaeger et al., 2007) and specific regulation of tumor FN expression by constitutive ERK/MAP kinase signaling has been shown, indicating that self-production of this matrix component may promote melanoma cell invasion (Gaggioli and Sahai, 2007). FGF-2 is established as a key modulator of melanoma progression however, its effects on melanoma cell adhesion and migration capabilities are not well known.
In this study we showed that M5 human metastatic melanoma cells’ ability to migrate was significantly enhanced by exogenously added FGF-2 while, neutralization of endogenous FGF-2 stimulates their adhesion. Previously, we have demonstrated that FGF-2 distinctly modulates the synthesis of individual glycosaminoglycans/proteoglycans (GAGs/PGs) subclasses, changing both their
11
12
amounts and distribution in M5 cells. Here, treatment with FGF-2 strongly reduced the expression levels of the heparan sulfate-containing proteoglycan, syndecan-4. Syndecan-4 is a focal adhesion component in a range of cell types, adherent to several different matrix molecules, including fibronectin (FN). The reduction in syndecan-4 expression by utilizing specific siRNA discriminately increased melanoma cell motility and decreased their attachment on FN, demonstrating a regulatory role of syndecan-4 on these cell functions. Syndecan-4 has previously been demonstrated to regulate focal adhesion kinase (FAK) phosphorylation. In this study FGF-2 was shown to downregulate FAK Y397-phosphorylation during FN-mediated M5 cell adhesion, promoting their migration. The observed decrease in FAK Y397 activation was correlated to syndecan-4 expression levels. Thus, a balance in syndecan-4 expression perpetrated by FGF-2 may be required for optimal M5 cell migration. These results suggest that essential in melanoma progression FGF-2, specifically regulates melanoma cell ability to migrate through a syndecan-4 dependent mechanism.
Summarizing, the results of this PhD thesis demonstrated the crucial role of PGs and GAGs on the basic and FGF-2 induced cell proliferation, adhesion and migration of melanoma cells and normal melanocytes.
(EN)
