Ανίχνευση μεταλλάξεων του γονιδίου KRAS με τη χρήση PNA-based qPCR στο κυκλοφορούν DNA του πλάσματος ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου
Detection of KRAS gene mutations by PNA-based qPCR in plasma cell-free DNA of colorectal cancer patients
Γκουντάκος, Αναστάσιος Ι.
Μαυρουδής, Δ.
Βενυχάκη, Μ.
Σουρβίνος, Γ.
Εισαγωγή: Ο καρκίνος του παχέος εντέρου αποτελεί τον τρίτο σε συχνότητα καρκίνο και τη δεύτερη αιτία θανάτου από κακοήθη νόσο. Πλήθος δημοσιεύσεων έχει περιγράψει την ύπαρξη ελεύθερων νουκλεϊκών οξέων στην κυκλοφορία τα οποία εντοπίζονται σε υψηλά επίπεδα σε διάφορες ασθένειες συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου και τα οποία θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως βιοδείκτες για τη διάγνωση και παρακολούθηση της νόσου. Στόχος της παρούσας ερευνητικής εργασίας αποτέλεσε η διερεύνηση της ύπαρξης μεταλλάξεων του γονιδίου KRAS στο κυκλοφορούν DNA του πλάσματος ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου.
Υλικά και Μέθοδοι: Το κυκλοφορούν DNA απομονώθηκε με τη βοήθεια ενός εμπορικά διαθέσιμου πρωτοκόλλου και τα επίπεδα συγκέντρωσής του στο πλάσμα και στον ορό ασθενών και υγιών προσδιορίστηκαν με μια ευαίσθητη και αξιόπιστη PCR πραγματικού χρόνου. Επιπλέον, η ανίχνευση τριών από των πιο συχνών μεταλλάξεων του γονιδίου KRAS πραγματοποιήθηκε με μια ειδικά σχεδιασμένη PNA-based PCR πραγματικού χρόνου.
Αποτελέσματα: Οι παρατηρήσεις αυτής της μελέτης επιβεβαιώνουν τη σπουδαιότητα ενός δεύτερου βήματος φυγοκέντρησης κατά τη διαδικασία απομόνωσης πλάσματος. Επίσης, η επεξεργασία των αποτελεσμάτων ποσοτικοποίησης κατέδειξε την ύπαρξη στατιστικά σημαντικά υψηλότερων επιπέδων κυκλοφορούντος DNA στον ορό και πλάσμα ασθενών σε σύγκριση με υγιή άτομα. Επιπλέον, η τεχνική ανίχνευσης μεταλλάξεων του γονιδίου KRAS που εφαρμόστηκε σε κυκλοφορούν DNA του πλάσματος εντόπισε μεταλλάξεις σε 5/9 (55%) δείγματα πριν την έναρξη θεραπείας και σε 8/10 (80%) δείγματα μετά τη θεραπεία.
Συζήτηση: Συνολικά, τα αποτελέσματα αυτής της ερευνητικής μελέτης δείχνουν πως το κυκλοφορούν DNA ανιχνευόμενο με ευαίσθητες τεχνικές εντοπισμού μπορεί να αποτελέσει ενα καινοτόμο και αξίοπιστο μοριακό βιοδείκτη για τη ταχύτερη διάγνωση και παρακολούθηση των μεταλλάξεων του γονιδίου RAS σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου.
(EL)
Introduction: Colorectal cancer (CRC) is one of the leading causes of cancer-related death in the Western world while the mortality and survival rates are highly influenced by the stage of disease at diagnosis. Several reports have demonstrated the existence of elevated cell-free DNA levels in the circulation of CRC patients, suggesting the possibility to develop and validate a reliable non-invasive genetic biomarker. The purpose of this study was to investigate the presence of KRAS mutations in plasma cell-free DNA from patients with CRC.
Materials and Methods: Cell-free DNA was extracted by QIAamp CNA kit and serum and plasma cell-free DNA levels were quantified by quantitative real-time PCR. The identification of three of the most common KRAS mutations on codon 12 and 13 was performed by Peptide Nucleic Acid (PNA)-based qPCR assay.
Results: Our observations confirmed the significance of the 2-step centrifugation during the plasma isolation. The data of this study also demonstrated the presence of significantly higher serum and plasma cfDNA levels in CRC patients compared to healthy individuals (control group). Moreover, the mutation analysis in the plasma cfDNA revealed detectable KRAS mutations in 5/9 (55%) pre-chemotherapy samples and in 8/10 (80%) post-chemotherapy samples.
Conclusions: Our results suggest that circulating cell-free DNA detectable with a well-known and validated qPCR assay could represent an innovative, minimally invasive approach to detect and monitor RAS mutation status in CRC patients.
(EN)
