Η αθηροσκλήρωση είναι φλεγμονώδης διαδικασία. Η ανάπτυξη των αθηρωματικών
βλαβών είναι το αποτέλεσμα της αλληλεπίδρασης κυτταρικών πληθυσμών του
περιφερικού αίματος, (κυρίως μονοκύτταρων και Τ-λεμφοκύτταρων), με κυτταρικούς
πληθυσμούς του τοιχώματος των αγγείων, (ενδοθηλιακά και λεία μυϊκά κύτταρα).
Προφλεγμονώδεις διαμεσολαβητές, συμμετέχουν στην ενορχήστρωση αυτής της
διαδικασίας.
Οι χημοκίνες είναι χαμηλού μοριακού βάρους χημειοτακτικές κυτοκίνες με σημαντική
ρυθμιστική δράση στην ενεργοποίηση και μετανάστευση των λευκοκυττάρων.
Αποτελούν μια επεκτεινόμενη οικογένεια περίπου 50 χημειοτακτικών πρωτεϊνών και 20
υποδοχέων ταξινομημένων σε τέσσερις υπο-οικογένειες. Οι χημοκίνες εμπλέκονται
σχεδόν σε κάθε φλεγμονώδη απάντηση και παίζουν σημαντικό ρόλο στην παθογένεια
ενός μεγάλου αριθμού φλεγμονωδών νοσημάτων μεταξύ των οποίων και η
αθηροσκλήρωση.
Η συμμετοχή των χημοκινών σε σημαντικούς μηχανισμούς της αθηρογένεσης καθιστά
αυτές και τους υποδοχείς τους πιθανούς μελλοντικούς θεραπευτικούς στόχους στην
αντιμετώπιση της στεφανιαίας νόσου.
Η fractalkine (FKN) είναι το μοναδικό μέλος της οικογένειας των CX3C χημοκινών.
Υπάρχει σε διαμεμβρανική και διαλυτή μορφή. Η διαλυτή FKN αποτελεί έναν ισχυρό
χημειοτακτικό παράγοντα για τα μονοκύτταρα και τα ενεργοποιημένα Τ-λεμφοκύτταρα.
Ο υποδοχέας της FKN (CX3CR1) αποτελείται από επτά διαμεμβρανικές περιοχές είναι
συζευγμένος με G-πρωτεΐνη και έχει υψηλή συγγένεια για την FKN. Η αλληλεπίδραση
χημοκίνης/υποδοχέα ενεργοποιεί ενδοκυτταρικά μονοπάτια και μεσολαβεί άμεσα στην
προσκόλληση και μετανάστευση των μονοκυττάρων.
Μέσω των μοναδικών δομικών και λειτουργικών χαρακτηριστικών της, η FKN κατέχει
τόσο χημειοτακτικές ιδιότητες όσο και ιδιότητες μορίου προσκόλλησης. Είναι συνεπώς,
ιδανικός υποψήφιος για έναν ουσιαστικό ρόλο στην αθηροσκλήρωση. Η αλληλεπίδραση
της FKN με τον υποδοχέα της CX3CR1 αποτελεί βιοχημικό μονοπάτι με σημαντικό
ρόλο στη συσσώρευση φλεγμονωδών κυττάρων στον έσω χιτώνα του αγγείου.
Διερευνήσαμε τη σχέση FKN/CX3CR1 και στεφανιαίας νόσου με δύο τρόπους.
Εφαρμόζοντας γενετική επιδημιολογία αναζητήσαμε την επίδραση πολυμορφισμών που
επηρεάζουν την δραστικότητα του FKN/CX3CR1 μονοπατιού στην πιθανότητα
εκδήλωσης στεφανιαίας νόσου. Κατόπιν σε in vitro κυτταρικά μοντέλα μελετήσαμε την
συμπεριφορά του υποδοχέα της FKN υπό την επίδραση προφλεγμονωδών παραγόντων
και φαρμάκων με γνωστή πλειοτρόπο αθηρο-προστατευτική δράση.
Έχουν περιγραφεί δύο μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί στον υποδοχέα της FKN:
T280M και V249I. Ο ένας εξ αυτών (Τ280Μ) μειώνει την ικανότητα αλληλεπίδρασης
FKN/CX3CR1. Μελετήσαμε την συχνότητα των δύο πολυμορφισμών (αλλά και τριών
ακόμα πολυμορφισμών σε γονίδια χημοκινών και υποδοχέων τους) σε 210 ασθενείς με
τεκμηριωμένη αγγειογραφικά ποικίλης βαρύτητας στεφανιαία νόσο και 165 μάρτυρες με
φυσιολογικά στεφανιαία αγγεία. Συνθέσαμε απλότυπους και συνδυασμένους
γονότυπους. Διαπιστώσαμε μεγαλύτερη συχνότητα των γονοτύπων που περιείχαν το
280M αλλήλιο σε ομόζυγη ή ετερόζυγη μορφή στον υγιή πληθυσμό (24.3 έναντι 33.9, p
=0.04). Διαπιστώσαμε επίσης μεταξύ των ασθενών μειωμένη βαρύτητα στεφανιαίας
νόσου (εκφραζόμενη από τον μέσο αριθμό αγγείων με βλάβη) στους φέροντες το 280Μ
αλλήλιο (1.65 ±0.11 έναντι 1.94 ±0.07 p=0.03). Το αποτέλεσμα είναι απόλυτα συμβατό
με προηγούμενες παρατηρήσεις που συσχετίζουν την παρουσία του 280M αλληλίου με
δυσλειτουργία του FKN/CX3CR1 μονοπατιού και ενισχύει έμμεσα την θεωρεία της
συμμετοχής του τελευταίου στην εγκατάσταση και εξέλιξη των αθηρωματικών βλαβών.
Στη συνέχεια θελήσαμε να μελετήσουμε διαφορές στην δραστικότητα του
FKN/CX3CR1 μονοπατιού μεταξύ ασθενών με στεφανιαία νόσο και υγιών μαρτύρων.
Μετρήσαμε με κυτταρομετρία ροής την επιφανειακή έκφραση του υποδοχέα CX3CR1
σε μονοκύτταρα απομονωμένα από 13 ασθενείς με αγγειογραφικά τεκμηριωμένη
στεφανιαία νόσο και 13 υγιείς μάρτυρες. Διαπιστώσαμε μεγαλύτερα ποσοστά CX3CR1-
θετικών μονοκυττάρων στους στεφανιαίους ασθενείς σε σχέση με τους μάρτυρες
(35.5±19.3 έναντι 19.8±7.5, p=0.01).
Σε δεύτερη φάση διερευνήσαμε πως συμπεριφέρεται ο υποδοχέας CX3CR1 υπό την
επίδραση φλεγμονωδών παραγόντων (TNF-α, INF-γ, αγγειοτενσίνη Ι και αγγειοτενσίνη
ΙΙ) που συμβάλλουν στην σύνθεση του μικροπεριβάλλοντος του δυσλειτουργούντος
αγγείου. Επιλέξαμε δύο κυτταρικούς πληθυσμούς που κυρίως αλληλεπιδρούν με το
αγγειακό ενδοθήλιο κατά την δημιουργία των αθηρωματικών βλαβών: περιφερικά
μονοκύτταρα (THP-1 κύτταρα αλλά και πρωτογενή μονοκύτταρα απομονωμένα από
υγιείς δότες) και Τ-λεμφοκύτταρα (Jurkat κύτταρα). Με την χρήση κυτταρομετρίας ροής
διαπιστώσαμε ότι ο η ιντερφερόνη (INF)-γ αυξάνει το ποσοστό των CX3CR1-θετικών
κυττάρων στην μονοκυτταρική σειρά THP-1 (45.1±10.1 έναντι. 63.4±9.8, p =0.006). Δεν
διαπιστώθηκε καμία επίδραση στο ποσοστό των CX3CR1-θετικών κυττάρων στους
λοιπούς κυτταρικούς πληθυσμούς που μελετήθηκαν υπό την επίδραση των τριών
παραγόντων.
Τέλος θελήσαμε να δούμε αν παράγοντες με πλειοτροπικές αθηροπροστατευτικές
δράσεις επηρεάζουν την έκφραση του υποδοχέα CX3CR1 σε μονοκυτταρικούς
πληθυσμούς. Χρησιμοποιήσαμε τους ανταγωνιστές του μετατρεπτικού ενζύμου (α-
ΜΕΑ), καπτοπρίλη και λισινοπρίλη και τον ανταγωνιστή των ΑΤ1 υποδοχέων της
αγγειοτενσίνης, λοσαρτάνη. Δεν διαπιστώσαμε σημαντικές επιδράσεις των α-ΜΕΑ στην
επιφανειακή έκφραση του CX3CR1 υποδοχέα σε κύτταρα THP-1 ή μονοκύτταρα
απομονωμένα από υγιείς δότες. Μία οριακή αύξηση των CX3CR1-θετικών
μονοκυττάρων παρατηρήθηκε 24 ώρες μετά από επώαση με λοσαρτάνη (49.2±3.7 έναντι
56.8±1.2, p=0.02). Το τελευταίο φαινόμενο σαφώς δεν μπορεί να συγκαταλεχθεί στις
αθηροπροστατευτικές ιδιότητες της λοσαρτάνης. Υποδεικνύει όμως την ικανότητα των
φαρμάκων της κατηγορίας αυτής να επιδρούν στην έκφραση των υποδοχέων χημοκινών
και κατ’ επέκταση στην δραστικότητα φλεγμονωδών μηχανισμών.
Εν κατακλείδι, διαπιστώσαμε ότι η δυσλειτουργία του CX3CR1/FKN βιοχημικού
μονοπατιού (όπως επί παρουσίας του 280Μ αλληλίου) μειώνει την πιθανότητα
εκδήλωσης στεφανιαίας νόσου. Δείξαμε επίσης ότι ασθενείς με στεφανιαία νόσο
παρουσιάζουν αυξημένα επίπεδα CX3CR1-θετικών μονοκυττάρων στο περιφερικό αίμα
και ότι το τελευταίο φαινόμενο θα μπορούσε να αποδοθεί στα αυξημένα επίπεδα
κυτοκινών όπως η INF-γ που συνθέτουν το φλεγμονώδες μικροπεριβάλλον του
αθηρωματικού αγγείου. Όλες αυτές οι παρατηρήσεις υποστηρίζουν τον ρόλο της FKN
και του υποδοχέα της στους φλεγμονώδεις μηχανισμούς που οδηγούν στην δημιουργία
των αθηρωματικών βλαβών και επιβεβαιώνουν το ενδιαφέρον για πιθανή αξιοποίηση
τους σαν διαγνωστικούς δείκτες ή θεραπευτικούς στόχους.
(EL)
Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of the vascular wall. It is mainly
preceded through interaction of monocytes with endothelial cells, and involves
chemokine signalling and adhesion molecule responses on both types of cells. Several
chemokine ligands and receptors have been extensively investigated and have been
proved to be involved in a more disease-specific way in atherosclerosis.
Chemokines are low molecular weight chemoattractant cytokines known to be major
regulatory proteins in leukocyte trafficking and activation. They consist of an expanding
family of approximately 50 ligands and 20 receptors which are classified into four subgroups.
Chemokines are involved in almost every inflammatory response and play an
important role in the pathogenesis of a wide variety of infectious and inflammatory
diseases, such as, atherosclerosis. Indeed, recent evidence suggests a pivotal role of
chemokines in important aspects of atherogenesis, thus rendering them potential
therapeutic target of coronary artery disease (CAD).
Fractalkine, the only member of the CX3C sub-family, has been implicated in
atherogenesis, since it can act both as a chemotactic agent recruiting monocytes and Tcells
in the site of inflammation, and as an adhesion molecule contributing to the
diapedesis of leukocytes in inflamed tissues. The receptor of fractalkine (CX3CR1) is a
seven transmembrane domain G protein-coupled receptor, and fractalkine binds to it with
high affinity, activating intracellular signalling and directly mediating monocyte
adhesion.
Through its unique structural and functional characteristics, fractalkine is a “perfect”
candidate for an exceptional role in the pathogenesis of atherosclerosis.
In the present study, we investigated the potential role of fractalkine in atherosclerosis in
two different settings. By applying a population genetic study we evaluated the impact of
functional polymorphisms in the CX3CR1 gene on susceptibility to coronary artery
disease. Then using an in vitro cell-culture model we evaluated the expression of
CX3CR1 in the presence or absence of inflammatory stimuli and after treatment with
agents with established anti-inflammatory properties.
Two single nucleotide polymorphisms have been described in the DNA sequence of the
CX3CR1 gene: V249I and T280M. The latter polymorphism has been associated with
reduced affinity of the receptor for its ligand. We evaluated the frequency of the above
two polymorphisms along with three common polymorphisms of chemokine ligands and
receptors (CCR2-64I, CCR5-Δ32, SDF1-3’A) in 210 angiographically diagnosed CAD
patients and 165 controls with normal coronary arteries. We constructed haplotypes and
combined genotypes. We concluded to a higher frequency of 280M containing genotypes
in homozygote or heterozygote state in the control group (24.3 vs. 33.9 p=0.04). We also
observed lower severity of CAD –expressed as mean number of diseased vessels- among
patients carrying the 280M allele (1.65 ±0.11 vs. 1.94 ±0.07 p=0.03). These results are in
agreement with previous observations implicating the presence of the 280M allele with
dysfunction of the FKN/CX3CR1 pathway, and indicate its role in the establishment and
progression of atherosclerosis.
We further evaluated differences in FKN/CX3CR1 activity in patients with CAD and
healthy controls. We measured, applying flow cytometry, expression of CX3CR1 in the
surface of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) isolated from 13 patients with
angiographically diagnosed CAD and 13 healthy controls. We observed higher rate of
CX3CR1-positive cells in the monocyte gate of patients compared to controls.
In order to further explore the possible implication of FKN/CX3CR1 in atherosclerosis
we evaluated the CX3CR1 behavior in the presence of inflammatory factors (TNF-α,
INF-γ, angiotensin I and angiotensin II) involved in the establishment of the
inflammatory micro-environment of the dysfunctional endothelium. Since, activated Tlymphocytes
and monocytes/macrophages are the PBMC-subpopulations most actively
implicated in atherosclerosis, the expression of CX3CR1 along with the expression of a
representative receptor of each major chemokine family (CCR5 and CXCR4) was
assessed by flow cytometry in two cell lines (THP-1 monocytes and Jurkat T-
lymphocytes) and primary monocytes isolated from healthy donors. Cells were evaluated
in naïve state and after treatment with TNF-α, INF-γ, ANG-I and ANG-II. We
demonstrated that INF-γ has the ability to significantly increase the CX3CR1 expression
of THP-1 monocytes. We did not observe any effect in the fluorescence intensity or the
rate of CX3CR1-positive cells in the rest of the studied cellular populations after
treatment with the above agents.
We further attempted to determine whether angiotensin converting enzyme (ACE)
inhibitors could decrease monocyte bioactivity through alteration of CX3CR1
expression. We treated THP-1 cells and primary monocytes with the ACE inhibitors,
captopril and lisinopril, and the angiotensin receptor blocker (ARB), losartan. Despite the
previously reported multiple anti-atherogenic properties of ACE inhibitors we concluded
that both captopril and lisinopril have no effect on THP-1 cells’ and primary monocytes’
chemokine-receptor surface profile. However, ARB losartan significantly increased the
rate and fluorescence intensity of CX3CR1-positive primary monocytes. This is a rather
unexpected effect since up-regulation of CX3CR1 could not be considered as an antiatherogenic
effect of ARBs. Nevertheless it is still an indication that angiotensin pathway
modulators have the ability to alter the chemokine receptor profile of monocytes.
In summary, we concluded that dysfunction of the CX3CR1/FKN pathway (mediated by
functional polymorphisms of the CX3CR1 gene) reduce susceptibility to CAD.
Furthermore, we demonstrated higher rate of CX3CR1-positive monocytes in CAD
patients compared to controls. The latter observation could be attributed to increased
levels of pre-inflammatory agents such as INF-γ that compose the inflammatory microenvironment
of the diseased vessel. The present data underline the role of the
FKN/CX3CR1 pathway in the inflammatory processes involved in atherosclerosis, thus
rendering it a potential therapeutic target.
(EN)
