Molecular analysis of two transcription factors (hCSDA and DbpB) related to the transcriptional activity of human α-globin gene promoters

 
Το τεκμήριο παρέχεται από τον φορέα :
Πανεπιστήμιο Κρήτης
Αποθετήριο :
E-Locus Ιδρυματικό Καταθετήριο
δείτε την πρωτότυπη σελίδα τεκμηρίου
στον ιστότοπο του αποθετηρίου του φορέα για περισσότερες πληροφορίες και για να δείτε όλα τα ψηφιακά αρχεία του τεκμηρίου*
κοινοποιήστε το τεκμήριο




1998 (EL)
Μοριακή ανάλυση δύο μεταγραφικών παραγόντων (hCSDA, DbpB) και συσχετισμός τους με τη μεταγραφική ενεργότητα των υποκινητών των γονιδίων της α-σφαιρίνης του ανθρώπου
Molecular analysis of two transcription factors (hCSDA and DbpB) related to the transcriptional activity of human α-globin gene promoters

Κονταράκη, Ιωάννα

Μοσχονάς, Νικόλαος

Προκειμένου να απομονωθούν πρωτεϊνικά μόρια που αλληλεπιδρούν με την περιοχή από -492 ως -477 (θέση G7) του υποκινητή της α-σφαιρίνης τα οποία ενδεχομένως παίζουν ρυθμιστικό ρόλο, χρησιμοποιήθηκε βιβλιοθήκη έκφρασης μορίων cDNA από ερυθρολευχαιμικά κύτταρα K562, και απομονώθηκε ένα μόριο cDNA το οποίο κωδικοποιεί για μια πρωτεΐνη που ονομάσαμε "human Cold Shock Domain protein A" (hCSDA) η οποία ταυτίζεται με την DbpAv, και ένα μόριο cDNA, ταυτόσημο με το cDNA που κωδικοποιεί για την "DNA binding protein B" (DbpB). Oι hCSDA και DbpB ανήκουν σε μια οικογένεια πρωτεϊνών που χαρακτηρίζεται από την ύπαρξη μιας συντηρημένης πρωτεϊνικής περιοχής, της "Cold Shock Domain", η οποία παρουσιάζει δυνατότητα πρόσδεσης σε μονόκλωνα και δίκλωνα νουκεϊκά οξέα (DNA και RNA). Mέλη αυτής της οικογένειας έχουν απομονωθεί από διάφορους οργανισμούς, συμπεριλαμβανομένων βακτηρίων, φυτών και ζώων. Tμήματα cDNA της hCSDA χρησιμοποιήθηκαν για το χρωμοσωμικό εντοπισμό των αντίστοιχων γονιδίων με ανάλυση Southern σε DNA από μονοχρωμοσωμικά κυτταρικά υβρίδια ανθρώπου - τρωκτικού. Tα δύο γονίδια χαρτογραφήθηκαν στα χρωμοσώματα 12 και 16. Eπίσης, γενωμικοί κλώνοι από ανθρώπινες βιβλιοθήκες YAC και PAC που αντιστοιχούν στο γονίδιο που χαρτογραφείται στο χρωμόσωμα 16, απομονώθηκαν και αξιοποιήθηκαν για την ταυτοποίηση και τον ακριβέστερο χρωμοσωμικό εντοπισμό του αντίστοιχου γονιδίου με ανάλυση FISH. To γονίδιο αυτό εντοπίστηκε στη χρωμοσωμική θέση 16p11.2. H σχετική μεταγραφική ενεργότητα των γονιδίων της hCSDA και της DbpB διαφέρει σε μια σειρά ιστών και κυτταρικών σειρών ανθρώπου και ποντικού, και καταστέλλεται σε ερυθροειδικές (K562 και MEL) ή μυελοειδικές κυτταρικές σειρές (HL-60) μετά από χημική επαγωγή διαφοροποίησης. Aντίστροφη συσχέτιση των επιπέδων αφθονίας των μεταγράφων της hCSDA και της DbpB με τα αυξημένα επίπεδα εκείνων της α-σφαιρίνης σε διαφοροποιημένες ερυθροειδικές σειρές, υποδεικνύει πιθανή αρνητική ρύθμιση των γονιδίων της α-σφαιρίνης από τις πρωτεΐνες αυτές. Eπιπλέον, η καταστολή της έκφρασης της hCSDA και της DbpB σε διαφοροποιημένες κυτταρικές σειρές υποδηλώνει πιθανή εμπλοκή αυτών των πρωτεϊνών στους μηχανισμούς ρύθμισης του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Πρωτεΐνες hCSDA και DbpB που είχαν εκφραστεί σε βακτήρια χρησιμοποήθηκαν για τον προσδιορισμό της ειδικότητας πρόσδεσης σε μονόκλωνο και δίκλωνο DNA της θέσης G7. Oι πρωτεΐνες αναγνωρίζουν μια διαδοχή πολυπυριμιδίνης, η οποία θα μπορούσε να συμμετέχει στο σχηματισμό δομής H-DNA και προσδένονται με 10 φορές μεγαλύτερη συγγένεια σε μονόκλωνο απ’ ότι σε δίκλωνο ολιγονουκλεοτίδιο που αντιστοιχεί στη θέση G7, αν και φαίνεται να υπάρχει μεγαλύτερη εξειδίκευση αλληλουχίας για την πρόσδεση σε δίκλωνα μόρια. H πρόσδεση σε μονόκλωνο DNA και η σταθεροποίηση της δομής H-DNA είναι ένας πιθανός μηχανισμός αρνητικής μεταγραφικής δράσης μέσω παρεμπόδισης της πρόσδεσης θετικών παραγόντων στην περιοχή. Πειράματα συνδιαμόλυνσης φορέων έκφρασης της hCSDA και της DbpB και διαφόρων κατασκευών αναφοράς του υποκινητή της α-σφαιρίνης σε κύτταρα K562, COS-7 και HeLa, έδειξαν ότι οι πρωτεΐνες hCSDA και DbpB δρουν αρνητικά στη μεταγραφική ενεργότητα του υποκινητή της α-σφαιρίνης μέσω της πρόσδεσής τους στη θέση G7 αλλά και σε παρόμοιες αλληλουχίες του υποκινητή. Δείχτηκε επίσης ότι οι πρωτεΐνες hCSDA και DbpB αλληλεπιδρούν άμεσα με τον μεταγραφικό παράγοντα Sp1. O υποκινητής της α-σφαιρίνης περιέχει πολλαπλές θέσεις πρόσδεσης για τον παράγοντα Sp1. Φαίνεται ότι ο Sp1 παίζει σημαντικό ρόλο για την αλληλεπίδραση του στοιχείου HS40 με τον υποκινητή. Έχει υποτεθεί ότι θα μπορούσε να συμμετέχει στην από μακριά ερυθροειδική ενεργοποίηση υποκινητών σφαιρινών μέσω της αλληλεπίδρασής του με την πρωτεΐνη GATA-1. Ένας πιθανός τρόπος δράσης της hCSDA και της DbpB θα μπορούσε να είναι η παρεμπόδιση της αλληλεπίδρασης του παράγοντα Sp1 με την πρωτεΐνη GATA-1 και συνεπώς της αλληλεπίδρασης του ρυθμιστικού στοιχείου HS-40 με τους υποκινητές της α-σφαιρίνης. (EL)
Screening of an expression library for regulatory factors interacting with the -492 to -477 region of the human a-globin promoter (site G7), revealed a cDNA designated as human Cold Shock Domain protein A (hCSDA) and a cDNA identical to a previously described as DNA binding protein B (DbpB) (Sakura et al., 1988). hCSDA is highly homologous to the previously reported DNA binding protein A (DbpA) (Sakura et al., 1988) and identical to DbpAv (Coles et al., 1996). These proteins belong to an ancient family characterized by a highly conserved structural motif, the "Cold Shock Domain" (Schindelin et al., 1993; Schnuchel et al., 1993), which has affinity for a variety of DNA sequence motifs as well as RNA. Members of this family have been identified in a number of organisms including bacteria, (Av-Gay et al., 1992; Jones et al., 1992; Willimsky et al., 1992), plants (de Oliveira et al., 1990) and animals (Tafuri et al., 1993; Tafuri and Wolffe, 1990; Wolffe, 1993; Wolffe et al., 1992). Phylogenetic analysis shows that the "Cold Shock Domain" protein family is highly conserved throughout evolution, and contains members which can be subdivided in distinct subfamilies. hCSDA cDNA fragments were used for chromosomal localization of the hCSDA genes by Southern analysis of monochromosomal human/rodent cell hybrid DNA panel. Isolated genomic clones (YAC and PAC) corresponding to hCSDA sequences were used for FISH analysis revealing an intron-less pseudogene mapped to chromosome 16p11.2. Examination of the specific distribution of hCSDA and DbpB mRNAs in human and mouse tissues and cell lines and in mouse embryos, carried out by Northern analysis, revealed that hCSDA and DbpB genes show differential levels of expression in different tissues and cell lines and their levels of expression decline in late stages of mouse embryo development. In addition, their expression levels are downregulated after differentiation of erythroid and myeloid cell lines (K562, MEL and HL-60). There is an inverse correlation of hCSDA and DbpB mRNA levels to the levels of the α-globin mRNA in differentiated erythroid cell lines (K562 and MEL) which is an indication of possible negative regulation of the α-globin gene promoter by these proteins. Moreover, downregulation of hCSDA and DbpB expression in differentiated cell lines may suggest a possible implication of these proteins in mechanisms underlying cell proliferation. To test DNA binding specificity to the G7 site and determine the consensus binding sequence for ds and ssDNA, hCSDA and DbpB cDNAs were cloned and expressed through bacterial expression vectors and the respective recombinant proteins, were used for DNA-protein binding studies. A 10 fold higher binding affinity was estimated for the ss compared to ds oligonucleotide corresponding to the G7 site. However, the sequence recognition specificity to dsDNA was determined to be more stringent compared to ssDNA. The consensus binding site for both ds and ssDNA is a polypyrimidine stretch which could participate in the formation of triple helix H-DNA structure. A possible way of short distance regulation of transcription by these proteins could be through their binding and stabilization on an H-DNA structure which could prevent the binding of neighboring positive regulators such as the Sp1 factor. In order to define the function of these proteins on the transcriptional activity of the human α-globin promoter, the cDNAs were cloned in eukaryotic expression vectors and used in transient cotransfection experiments together with a variety of α-globin promoter - CAT reporter constructs in K562, COS-7 and HeLa cells. This analysis suggested that hCSDA and DbpB affect negatively the transcription activity of the human α-globin promoter through their binding on the G7 site and similar sequences of the promoter. We also examined protein-protein interactions of hCSDA and DbpB proteins with the Sp1 transcription factor, which has an adjacent binding site to the G7 site, by gel shift analysis, and we identified that both proteins can physically interact with the Sp1 factor. Sp1 is the major positive factor of the α-globin promoter and the region of the promoter containing multiple Sp1 binding sites is necessary for its interaction with the enhancer regulatory element HS-40 (Pondel et al., 1995). It has been speculated that it may participate in LCR mediated erythroid specific activation of globin promoters through it’s ability to interact with the erythroid specific transcription factor GATA-1 (Merika and Orkin, 1995). GATA-1 binding on HS40 is crucial for HS-40 mediated transactivation of the α-globin promoters (Zhang et al., 1995; Rombel et al., 1995). A possible way of long-range action of hCSDA and DbpB could be through prevention of Sp1-GATA-1 interaction and subsequently the interaction of the HS-40 with the α-globin gene promoters. (EN)

Τύπος Εργασίας--Διδακτορικές διατριβές
text

Α-σφαιρίνη
Μεταγραφικές ρυθμίσεις
Χρωμοσωμικός εντοπισμός
Εξελίξεις

Πανεπιστήμιο Κρήτης (EL)
University of Crete (EN)

Ελληνική γλώσσα

1998-06-25


Σχολή/Τμήμα--Σχολή Θετικών και Τεχνολογικών Επιστημών--Τμήμα Βιολογίας--Διδακτορικές διατριβές



*Η εύρυθμη και αδιάλειπτη λειτουργία των διαδικτυακών διευθύνσεων των συλλογών (ψηφιακό αρχείο, καρτέλα τεκμηρίου στο αποθετήριο) είναι αποκλειστική ευθύνη των αντίστοιχων Φορέων περιεχομένου.