Υποκλωνοποίηση του γονιδίου του τύπου 2 υποδοχέα του CRF και φαρμακολογικός χαρακτηρισμός του υποδοχέα

 
This item is provided by the institution :
University of Crete
Repository :
E-Locus Institutional Repository
see the original item page
in the repository's web site and access all digital files if the item*
share




2016 (EN)
Subcloning the type 2 CRF receptor gene and pharmacological characterization of receptor
Υποκλωνοποίηση του γονιδίου του τύπου 2 υποδοχέα του CRF και φαρμακολογικός χαρακτηρισμός του υποδοχέα

Κανελλόπουλος, Παναγιώτης

Βενυχάκη, Μαρία
Λιαπάκης, Γεώργιος
Θερμού, Κυριακή

O εκλυτικός παράγοντας της κορτικοτροπίνης (corticotropin releasing factor ή CRF) είναι ένα πεπτίδιο 41 αμινοξέων το οποίο ρυθμίζει τη λειτουργία του κεντρικού νευρικού συστήματος (ΚΝΣ) καθώς και άλλων συστημάτων, παίζοντας έτσι σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της ομοιόστασης του οργανισμού. Ο CRF ασκεί τη πληθώρα των δράσεων του μέσω αλληλεπίδρασης του με τους τύπους 1 (CRF1R) και 2 (CRF2R) υποδοχέων του. Οι υποδοχείς αυτοί ανήκουν στην οικογένεια των υποδοχέων που συζευγνύονται με G-πρωτεΐνες (GPCRs). Οπως όλοι οι GPCRs έτσι και οι υποδοχείς του CRF αποτελούνται από εξωκυττάριες, ενδοκυττάριες, και επτά διαμεμβρανικές περιοχές (TMs). Παρά τη μεγάλη τους ομολογία, οι CRF1R και CRF2R παρουσιάζουν διαφορετικές συγγένειες για τα διάφορα ανάλογα του CRF. Πιο συγκεκριμένα οι δύο αυτοί τύποι υποδοχέων έχουν παρόμοια συγγένεια δέσμευσης για τη σοβαγίνη και την ουροκορτίνη, ενώ οι ουροκορτίνες ΙΙ και ΙΙΙ δεσμεύονται εκλεκτικά στον CRF2R. Αντίθετα, όλοι οι μέχρι σήμερα υπάρχοντες συνθετικοί μικρομοριακοί μη πεπτιδικοί ανταγωνιστές παρουσιάζουν εκλεκτικότητα για τον CRF1R. Ακόμα μεγαλύτερο ενδιαφέρον αποτελεί το γεγονός ότι όλα τα αμινοξέα των διαμεμβρανικών περιοχών του CRF1R τα οποία έχουν δειχθεί σε μια πρόσφατη κρυσταλλογραφική μελέτη του υποδοχέα αυτού ότι δεσμεύουν τους μικρομοριακούς ανταγωνιστές, διατηρούνται στον CRF2R ο οποίος όμως δεν δεσμεύει τους προσδέτες αυτούς. Το γεγονός αυτό οδηγεί στη υπόθεση ότι τα αμινοξέα αυτά έχουν διαφορετικούς προσανατολισμούς στον CRF1R από ότι στον CRF2R. Η έλλειψη όμως δομικών πληροφοριών για τον CRF2R αποτελεί εμπόδιο τόσο για την επαλήθευση της υπόθεσης αυτής όσο και για το προσδιορισμό των αμινοξέων που δεσμεύουν διάφορους προσδέτες, γεγονός που αποτελεί τροχοπέδη για το σχεδιασμό νέων CRF2R-εκλεκτικών μορίων. Καθοριστικό ρόλο στη διασαφήνιση της δομής και λειτουργίας του CRF2R παίζει η δημιουργία μεταλλάξεων του υποδοχέα με σκοπό το προσδιορισμό των δομικά-λειτουργικά σημαντικών αμινοξέων του. Το πρώτο βήμα για την επίτευξη του σκοπού αυτού έγινε στη παρούσα μελέτη στην οποία υποκλωνοποιήσαμε το γονίδιο του CRF2R στο pCNI4 πλασμίδιο δημιουργώντας έτσι το πλασμίδιο CRF2R/pCNI4 και χαρακτηρίσαμε φαρμακολογικά τον υποδοχέα (hCRF2R) που κωδικοποιεί. Το πλασμίδιο CRF2R/pCNI4 μας επιτρέπει τη πιο εύκολη, γρήγορη και αξιόπιστη έκφραση και έτσι μελέτη του CRF2R και των μεταλλαγμένων μορφών του που θα δημιουργηθούν. Η διαλεύκανση της δομής και λειτουργίας του CRF2R θα οδηγήσει στο σχεδιασμό νέων CRF2R-εκλεκτικών αναλόγων. Τα ανάλογα αυτά θα μας επιτρέψουν να διασαφηνίσουμε το ρόλο του CRF2R στη λειτουργία τόσο του ΚΝΣ όσο και άλλων συστημάτων του οργανισμού, προσφέροντας έτσι τη δυνατότητα να αντιμετωπίσουμε θεραπευτικά παθολογικές καταστάσεις στις οποίες εμπλέκεται ο CRF2R. (EL)
Corticotropin releasing factor (CRF) is a 41 amino acid peptide, which regulates the function of the central nervous system (CNS) and other systems as well, thus playing an important role in the maintenance of the homeostasis. CRF exerts its multiple effects through its interaction with the type 1 (CRF1R) and type 2 (CRF2R) receptors. These receptors belong to the family of G-protein coupled receptors (GPCRs). CRF receptors, as all GPCRs, consist of extracellular and intracellular regions and seven transmembrane domains (TMs). CRF1R and CRF2R have different binding affinities for various CRF analogs. In specific, CRF1R and CRF2R have similar binding affinities for sauvagine and urocortin I. In contrast, urocortins II and III bind specifically to CRF2R, whereas all synthetic non-peptide antagonists are CRF1R-selective. Interestingly, all the TM amino acids of CRF1R, which have been shown in a recent crystallographic study to bind the CRF1R-selective non-peptide antagonists, are totally conserved in the CRF2R. This leads to the hypothesis that the amino acids of CRF1R that contact non-peptide molecules have different orientations in CRF2R, such as the high affinity binding of these molecules to CRF2R is not feasible. However the absence of structural information for the CRF2R hampers the verification of this hypothesis. In addition, the lack of structural information for this receptor impedes the determination of the amino acids that contact various ligands, which is the first step for the design of new CRF2R-selective molecules. To elucidate the structure and function of CRF2R, we must mutate its amino acids to different ones and determine the pharmacological properties of mutant receptors. To accomplish this, we must first create an efficient plasmid containing the CRF2R gene. In the present study we subcloned the CRF2R gene into the pCIN4 vector, thus creating the CRF2R/pCNI4 plasmid. Next we determine the functional properties of the protein encoded by the CRF2R/pCNI4 plasmid by expressing this protein (hCRF2R) into HEK cells and pharmacologically characterizing the hCRF2R. The CRF2R/pCNI4 plasmid allows the easier, faster and more reliable expression of CRF2R and possibly its mutants that will be created in our laboratory in order to elucidate the structure and function of this receptor. Determination of the structure and function of CRF2R will lead to the design of new CRF2R-selective analogs. These analogs will be extremely useful tools for the elucidation of the role of CRF2R in the function of CNS and other systems as well and possibly for the treatment of several pathological conditions in which the CRF2R is implicated. (EN)

text
Τύπος Εργασίας--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης

Εκλυτικός παράγοντας της κορτικοτροπίνης

Πανεπιστήμιο Κρήτης (EL)
University of Crete (EN)

Greek

2016-12-13


Σχολή/Τμήμα--Ιατρική Σχολή--Τμήμα Ιατρικής--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης



*Institutions are responsible for keeping their URLs functional (digital file, item page in repository site)