Methylation patterns of fetal growth regulatory genes correlation with the pathophysiology of spotaneous abortion and intrauterine growth restriction

 
Το τεκμήριο παρέχεται από τον φορέα :
Πανεπιστήμιο Κρήτης
Αποθετήριο :
E-Locus Ιδρυματικό Καταθετήριο
δείτε την πρωτότυπη σελίδα τεκμηρίου
στον ιστότοπο του αποθετηρίου του φορέα για περισσότερες πληροφορίες και για να δείτε όλα τα ψηφιακά αρχεία του τεκμηρίου*
κοινοποιήστε το τεκμήριο




2011 (EL)
Ο Μηχανισμός της μεθυλίωσης ρυθμιστικών γονιδίων εμβρυικής ανάπτυξης ως αιτιολογικός παράγοντας αυτόματων εκτρώσεων και ενδομήτριας υπολειπόμενης ανάπτυξης
Methylation patterns of fetal growth regulatory genes correlation with the pathophysiology of spotaneous abortion and intrauterine growth restriction

Κούκουρα, Ουρανία

Καναβάκης, Εμμανουήλ
Σπαντίδος, Δημήτριος
Κουμαντάκης, Ευγένιος

ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η ενδομήτρια υπολειπόμενη ανάπτυξη (ΕΥΑ) (intrauterine growth restriction IUGR) περιγράφει μία κατάσταση κατά την οποία το έμβρυο δεν μπορεί να αναπτυχθεί όσο του υπαγορεύει η γενετική του προδιάθεση. Τα νεογνά που γεννιούνται με ΕΥΑ είναι μικρότερα για τη δεδομένη ηλικία κύησης (μικρά για την ηλικία κύησης, small for gestational age SGA), και το βάρος τους είναι κάτω από την 10η ή 5η ή 3η εκατοστιαία θέση για την ηλικία κύησης, σύμφωνα με διαφορετικούς ορισμούς. Είναι πολύ σημαντικό να είμαστε σε θέση να διαγνώσουμε τα νεογνά που είναι μικρά για την ηλικία κύησης επειδή είχαν υπολειπόμενη ανάπτυξη κατά τη διάρκεια της ενδομήτριας ζωής τους, σε σχέση με αυτά που είναι «προγραμματισμένα» για να γεννηθούν μικρά. Τα νεογνά της πρώτης κατηγορίας, εμφανίζουν βραχυπρόθεσμες και μακροπρόθεσμες επιπτώσεις στην ανάπτυξη και υγεία τους γιατί ουσιαστικά κάποιος βλαπτικός παράγοντας επέδρασε στην ομαλή αύξηση τους κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ζωής τους με αποτέλεσμα να μην αναπτυχθούν όσο θα μπορούσαν με βάση τη γενετική τους προδιάθεση. Οι αιτιολογικοί παράγοντες που έχουν συσχετιστεί με την παθοφυσιολογία της ΕΥΑ έχουν παραδοσιακά χωριστεί σε 3 κατηγορίες: μητρικοί, εμβρυικοί και μητροπλακουντιακοί παράγοντες. Η πλακουντιακή ανεπάρκεια όμως αφορά την πλειοψηφία των περιπτώσεων ΕΥΑ. Η συνεχιζόμενη έρευνα για την ανεύρεση των παθογενετικών μηχανισμών της ΕΥΑ έχει συσχετίσει διαφορετικά γενετικά αίτια με την εμφάνιση της παθολογικής αυτής οντότητας. Παρόλα αυτά δεν έχει βρεθεί κάποιος παράγοντας ο οποίος μπορεί να προβλέψει την εμφάνιση ΕΥΑ από τα αρχικά στάδια της κύησης, ή να μπορεί να εξηγήσει την 10 παθοφυσιολογία της νόσου. Οι έρευνες σε μοριακό επίπεδο θα μπορούσαν να βοηθήσουν στη διαλεύκανση των διεργασιών που αφορούν την ΕΥΑ, η οποία είναι ξεκάθαρο πλέον ότι δεν αποτελεί μία μεμονωμένη νόσο, αλλά ένα σύμπτωμα πολλών διαφορετικών επιπλοκών της κύησης. Τα γονίδια αποτύπωσης αποτελούν μία κατηγορία γονιδίων που σχετίζονται με την αύξηση και τη λειτουργία του πλακούντα, και κατά συνέπεια αποτελούν ιδανικούς υποψηφίους για τη μελέτη γενετικών μηχανισμών που σχετίζονται με διαταραχές στην πλακουντιακή λειτουργία που συνεπάγονται καθυστέρηση της ανάπτυξης του εμβρύου. Η αποτύπωση αποτελεί ένα μοριακό μηχανισμό κατά τον οποίο μόνο το ένα αλληλόμορφο από ένα ζεύγος γονιδίων εκφράζεται, και εξαρτάται από την προέλευση του χρωμοσώματος του (μητρική ή πατρική) το κατά πόσο θα εκφραστεί ή όχι. Αυτή η ελεγχόμενη έκφραση, ρυθμίζεται από επιγενετικούς μηχανισμούς όπως η μεθυλίωση του DNA. Η μεθυλίωση της κυτοσίνης μπλοκάρει τον μηχανισμό μεταγραφής ενός γονιδίου. Η μεθυλίωση στους εκκινητές των γονιδίων έχει σαν αποτέλεσμα την μη αναγνώριση τους από τους παράγοντες μεταγραφής και την RNA πολυμεράση, αφού οι μεθυλιωμένες κυτοσίνες προτιμούν να συνδέονται με μία πρωτείνη η οποία ονομάζεται μεθυλ- κυτοσίνη συνδετική πρωτείνη ή MeCP. Όταν η περιοχή ενός εκκινητή αναγνωριστεί από έναν παράγοντα μεταγραφής ως μεθυλιωμένη, τότε η μεταγραφή θα ανασταλεί. Πολλά γονίδια αποτύπωσης εκφράζονται σε σημαντικό βαθμό στον πλακούντα και επηρεάζουν τη λειτουργία και τη μορφολογία του. Τα πατρικής προέλευσης εκφραζόμενα γονίδια ευνοούν την ανάπτυξη του εμβρύου, ενώ αντίθετα τα μητρικής προέλευσης εκφραζόμενα γονίδια «φρενάρουν» την ανεξέλεγκτη παροχή συστατικών προς το έμβρυο με στόχο την εξοικονόμηση πόρων προς όφελος της μητέρας και των επόμενων κυήσεων. 11 Τα γονίδια IGF2 και Η19 αποτελούν δύο γονίδια αποτύπωσης που μοιράζονται κοινούς μεταγραφικούς μηχανισμούς αλλά με αντίθετο τρόπο και παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του εμβρύου. Το γονίδιο IGF2 εκφράζεται από το πατρικό αλληλόμορφο και ευνοεί την ανάπτυξη του εμβρύου ενώ το μητρικό αλληλόμορφο δεν μεταγράφεται. Αντίθετα το μητρικό αλληλόμορφο του γονιδίου Η19 είναι εκείνο που εκφράζεται και αν και δεν κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη, θεωρείται πως έχει ιδιότητες που καταστέλλουν την ανάπτυξη. Ερευνητικές μελέτες έχουν καταδείξει συγκεκριμένες περιοχές των δύο γονιδίων που έχουν διαφορετικό προφίλ μεθυλίωσης σε κάθε αλληλόμορφο με αποτέλεσμα να ελέγχουν την έκφραση τους. Πιο συγκεκριμένα, μία περιοχή με διαφορετικό προφίλ μεθυλίωσης (Differentially Methylated Region DMR) που εδράζεται μεταξύ των δύο γονιδίων, είναι υπεύθυνη για την αντίθετη αποτύπωση των δύο γονιδίων. Αν η περιοχή αυτή είναι υπομεθυλιωμένη, τότε επιτρέπεται η σύνδεση της με τον παράγοντα CTC Factor (CTCF) ο οποίος εμποδίζει την δράση διεγερτών στους εκκινητές του IGF2 με αποτέλεσμα το IGF2 να μη μεταγράφεται και να μεταγράφεται το Η19. Αντίθετα αν η συγκεκριμένη περιοχή είναι μεθυλιωμένη η πρόσδεση του παράγοντα CTCF δεν επιτρέπεται με αποτέλεσμα οι διεγέρτες να επιδρούν στους εκκινητές του IGF2 και να μεταγράφεται το IGF2 και να μην εκφράζεται το Η19. Συνεπώς υπό φυσιολογικές συνθήκες το μητρικό αλληλόμορφο είναι υπομεθυλιωμένο και το IGF2 δεν μεταγράφεται σε αυτό ενώ μεταγράφεται το Η19. Το αντίθετο ισχύει για το πατρικό αλληλόμορφο. Διαταραχές στην έκφραση των συγκεκριμένων γονιδίων έχουν συσχετιστεί με σύνδρομα διαταραχών της ανάπτυξης πριν και μετά τη γέννηση αλλά υπάρχουν ελάχιστα δεδομένα που να αφορούν το ρόλο τους στην ΕΥΑ. Οι διαταραχές στον ευαίσθητο επιγενετικό έλεγχο της λειτουργίας των γονιδίων αποτύπωσης, θα μπορούσε να αποτελέσει έναν σημαντικό συνδετικό κρίκο μεταξύ περιβαλλοντικών 12 παραγόντων και εμβρυϊκής ανάπτυξης. Στην παρούσα ερευνητική μελέτη διερευνήθηκε ο ρόλος των γονιδίων αποτύπωσης IGF2 και Η19 στην παθογένεση της ΕΥΑ. Πιο συγκεκριμένα η υπόθεση η οποία ελέγχθηκε είναι κατά πόσο τα συγκεκριμένα γονίδια τα οποία έχουν θεμελιώδη ρόλο στην πρώιμη εμβρυϊκή ανάπτυξη, εμφανίζουν ανώμαλη έκφραση σε πλακουντιακούς ιστούς κυήσεων με ΕΥΑ σε σύγκριση με την έκφραση σε πλακούντες από φυσιολογικές κυήσεις. Διερευνήσαμε ταυτόχρονα αν παρατηρούνται διαταραχές στον μηχανισμό αποτύπωσης που μπορεί να συσχετιστούν με ανώμαλη έκφραση. Τέλος μελετήσαμε το επιγενετικό προφίλ αυτών των γονιδίων στους ίδιους ιστούς και πιο συγκεκριμένα συγκρίναμε τα επίπεδα μεθυλίωσης συγκεκριμένων περιοχών των γονιδίων που αποτελούν ρυθμιστικές περιοχές της αποτύπωσης, στις δύο υπό μελέτη ομάδες. Η βασική υπόθεση που προσπαθήσαμε να επαληθεύσουμε, είναι κατά πόσο διαταραχές στο μηχανισμό μεθυλίωσης μπορεί να έχουν άμεση επίδραση στο μοντέλο αποτύπωσης των IGF2/H19 και κατά συνέπεια στην έκφραση τους, και κατά πόσο αυτή η αλυσιδωτή μοριακή βλάβη, εφόσον υπάρχει, μπορεί να επηρεάσει την ομαλή ανάπτυξη του εμβρύου. ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ Συλλογή Υλικού Συλλέχθηκαν συνολικά 30 ιστοί που αποτελούσαν προϊόντα αποβολής πρώτου τριμήνου και 31 τεμάχια πλακουντιακού ιστού από κυήσεις με ΕΥΑ και 17 τεμάχια πλακουντιακοί ιστού από τελειόμηνες κυήσεις με ομαλή έκβαση που αποτελούσαν την ομάδα ελέγχου. Η διάγνωση της ενδομήτριας υπολειπόμενης ανάπτυξης είχε γίνει με διαδοχικές υπερηχογραφικές εκτιμήσεις κατά τη διάρκεια της κύησης. Το 13 πειραματικό μέρος πραγματοποιήθηκε στα δείγματα πλακουντιακού ιστού από τις δύο ομάδες κυήσεων. Πειραματικό μέρος Πραγματοποιήθηκε εκχύλιση DNA από τους πλακουντιακούς ιστούς με το πρωτόκολλο φαινόλης/χλωροφορμίου, και εκχύλιση RNA με το πρωτόκολλο του Trizol. Η ποσότητα του RNA υπολογίστηκε με φωτομέτρηση. Η διαδικασία της αντίστροφης μεταγραφής πραγματοποιήθηκε με το κιτ της Promega. Οι αντιδράσεις της real-time PCR πραγματοποιήθηκαν με το σύστημα Mx3000P real-time PCR system. Η έκφραση του δομικού γονιδίου Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) χρησιμοποιήθηκε για την ομαλοποίηση των επιπέδων έκφρασης των IGF2 και H19. Χρησιμοποιήθηκαν, τρία σετ primers για το IGF2 και ένα σετ primers για το Η19. Ελέγχθηκαν τρεις πολυμορφισμοί για το IGF2 και ένας για το Η19. Τα προιόντα της PCR ελέγχθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε τζελ αγαρόζης 3%. Η εξέταση δύο πολυμορφισμών έγινε μετά από πέψη με περιοριστικά ένζυμα. Η ανάλυση της μεθυλίωσης έγινε με τη μέθοδο MethyLight μετά από μετατροπή του DNA με όξινο θειώδες νάτριο. Το ποσοστό των πλήρως μεθυλιωμένων μορίων σε μία συγκεκριμένη περιοχή του γονιδίου υπολογίστηκε μετά από διαίρεση του λόγου ΓΟΝΙΔΙΟ:COL2A1 ενός δείγματος με το λόγο ΓΟΝΙΔΙΟ:COL2A1 του DNA Sssl-επεξεργασμένων λευκών αιμοσφαιρίων και πολλαπλασιασμένο επί 100. Η συντόμευση PMR (Percentage of Methylated Reference) υποδηλώνει την παραπάνω μέτρηση. 14 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Το βάρος γέννησης ήταν μικρότερο από την 5η εκατοστιαία θέση για όλες τις κυήσεις με ΕΥΑ και μεταξύ της 10ης και 90ης για της κυήσεις της ομάδας ελέγχου. Δεκατέσσερα IUGR δείγματα και 8 control ήταν ετερόζυγα για το H19. Δεκαέξι πλακούντες από την ομάδα των IUGR και 9 από την ομάδα ελέγχου ήταν ετερόζυγοι για τον IGF2. Από τα συνολικά 22 ετερόζυγα δείγματα για το Η19, απώλεια της αποτύπωσης (Loss Of Imprinting, LOI) διαπιστώθηκε σε 5 δείγματα, 4 από τα οποία ήταν φυσιολογικά και ένα παθολογικό. Από τα συνολικά 25 ετερόζυγα δείγματα για τον IGF2, διαπιστώθηκε απώλεια της αποτύπωσης σε 9 δείγματα, όλα προερχόμενα από την ομάδα με την ΕΥΑ. Τα επίπεδα πλακουντιακής έκφρασης ήταν ελαττωμένα στην ομάδα των IUGR (P=0.01) για τον IGF2 και αυξημένα για το Η19 (P=0.04). Η στατιστική ανάλυση δεν έδειξε συσχέτιση της έκφρασης των δύο γονιδίων με άλλες παραμέτρους όπως εμβρυϊκή ανάπτυξη, χαρακτηριστικά της μητέρας, βαρύτητα της υπολειπόμενης ανάπτυξης ή ηλικία κύησης. Η έκφραση και των δύο γονιδίων δεν διέφερε σημαντικά μεταξύ των πλακουντιακών ιστών που είχαν φυσιολογική και ανώμαλη αποτύπωση. Μελετήθηκαν 3 περιοχές που υπό κανονικές συνθήκες εμφανίζουν διαφορετικό βαθμό μεθυλίωσης μεταξύ μητρικού και πατρικού χρωμοσώματος (DMR). Η μία DMR που μελετήθηκε ήταν στους εκκινητές του γονιδίου IGF2 στα εξόνια 2/3, η άλλη περιοχή αφορούσε την DMR του εκκινητή του Η19 και τέλος την περιοχή που ελέγχει την αποτύπωση και των δύο γονιδίων (Imprinting Control Region ICR) η οποία βρίσκεται μεταξύ των δύο γονιδίων, πριν από τους εκκινητές του Η19. Οι πλακούντες με ΕΥΑ είχαν μικρότερη μέση τιμή PMR στους εκκινητές του IGF2 σε σχέση με την ομάδα ελέγχου (23.3% και 29.6% αντίστοιχα P=0,05). Οι τιμές της μεθυλίωσης δεν διέφεραν μεταξύ των δειγμάτων που είχαν απώλεια της 15 αποτύπωσης (LOI) και σε όσα είχαν φυσιολογική αποτύπωση (MOI). Επιπλέον, οι παθολογικοί πλακούντες είχαν χαμηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης στους εκκινητές του H19 σε σχέση με την ομάδα ελέγχου (22.3% και 32.4% αντίστοιχα P=0.02). Παρόλα αυτά δεν υπήρξε συσχέτιση της μεθυλίωσης και των διαταραχών της αποτύπωσης. Δεν διαπιστώθηκε συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων μεθυλίωσης και των επιπέδων mRNA των αντίστοιχων γονιδίων και δια τις δύο περιοχές που μελετήθηκαν. Τα ποσοστά μεθυλίωσης στην περιοχή που ελέγχει την αποτύπωση και των δύο γονιδίων (ICR) ήταν παρόμοια και στις δυο ομάδες δειγμάτων που μελετήθηκαν. Αν και οι πλακούντες που είχαν απώλεια της αποτύπωσης για τον IGF2, εμφάνιζαν υψηλότερα ποσοστά μεθυλίωσης σε σχέση με όσα διατηρούσαν τη μεθυλίωση, η διαφορά αυτή δεν ήταν σημαντική. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Από την παρούσα μελέτη προκύπτουν συμπεράσματα αλλά ανακύπτουν και κάποια ερωτήματα. Η μειωμένη έκφραση του IGF2 αποτελεί ένα εύρημα το οποίο έχει αναφερθεί και παλιότερα σε κυήσεις με ενδομήτρια υπολειπόμενη ανάπτυξη. Έχει βρεθεί πως η μειωμένη έκφραση του συγκεκριμένου γονιδίου έχει συσχετιστεί με μειωμένη ικανότητα διάχυσης θρεπτικών ουσιών από τον πλακούντα προς το έμβρυο. Η μειωμένη έκφραση του IGF2 που βρήκαμε στην παρούσα μελέτη, μπορεί να συνδέεται με τον αιτιολογικό μηχανισμό της ΕΥΑ ή να αποτελεί αποτέλεσμα της πλακουντιακής δυσλειτουργίας. Όσον αφορά τη αυξημένη έκφραση του Η19 στους πλακούντες κυήσεων με ΕΥΑ, αποτελεί ένα καινούριο εύρημα, που όμως έχει ήδη συσχετιστεί με καθυστερημένη ανάπτυξη μετά τον τοκετό σε πειραματικά μοντέλα με ποντίκια. 16 Η διαταραχή της αποτύπωσης που είχε ως αποτέλεσμα την διαλληλική έκφραση του IGF2 παρατηρήθηκε αποκλειστικά σε παθολογικούς πλακούντες. Η ανωμαλία αυτή έχει αναφερθεί και σε άλλες παθολογικές καταστάσεις που αφορούν τον πλακούντα όπως η μύλη κύηση και η προεκλαμψία. Δεν υπήρξε όμως η αναμενόμενη αυξημένη έκφραση του IGF2 στα δείγματα που είχαν απώλεια της αποτύπωσης. Η ανάλυση του ποσοστού της μεθυλίωσης στην περιοχή των εκκινητών του IGF2 έδειξε μειωμένο ποσοστό μεθυλίωσης στους πλακούντες με ΕΥΑ σε σχέση με αυτούς της ομάδας ελέγχου. Η υπομεθυλίωση στη συγκεκριμένη περιοχή μπορεί να συσχετιστεί με την απώλεια της αποτύπωσης των παθολογικών δειγμάτων, δεν μπορεί όμως να εξηγήσει τη μειωμένη έκφραση του IGF2 στην ίδια ομάδα. Επιπρόσθετα, δεν βρέθηκε να υπάρχει συσχέτιση της υπομεθυλίωσης με την διαταραχή της αποτύπωσης στα δείγματα με ΕΥΑ. Χαμηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης διαπιστώθηκαν και στην περιοχή των εκκινητών του Η19 στην ομάδα των παθολογικών πλακούντων. Αν και το συγκεκριμένο γεγονός θα μπορούσε να εξηγήσει την αυξημένη έκφραση του Η19, εντούτοις δε βρέθηκε συσχέτιση μεταξύ επιπέδων του mRNA και των PMR. Τέλος, ένα πολύ σημαντικό κομμάτι της μελέτης ήταν η ανάλυση της μεθυλίωσης της περιοχής που ελέγχει την αποτύπωση του IGF2 και του Η19. Τα παθολογικά δείγματα πλακούντων είχαν μικρότερα ποσοστά μεθυλίωσης σε σχέση με τα φυσιολογικά, αλλά σε μη στατιστικά σημαντικό βαθμό. Οι μετρήσεις των PMR δεν σχετίζονταν με τα επίπεδα mRNA κανενός από τα δύο γονίδια που μελετήθηκαν. Με σκοπό να διερευνήσουμε κατά πόσο η υπομεθυλίωση στην συγκεκριμένη περιοχή μπορεί να συσχετίζεται με διαταραχές της αποτύπωσης, αναλύσαμε τα ποσοστά μεθυλίωσης των δειγμάτων που εμφάνισαν απώλεια της αποτύπωσης προκειμένου για το IGF2 σε σχέση με όσα είχαν φυσιολογική 17 αποτύπωση. Αν και τα δείγματα με LOI είχαν υψηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης σε σχέση με όσα δεν εμφάνιζαν κάποια διαταραχή, η διαφορά αυτή δεν ήταν σημαντική. Είναι γεγονός πως οι μέχρι σήμερα γνώσεις μας όσον αφορά τους μηχανισμούς που ρυθμίζουν την αποτύπωση, είναι ανεπαρκείς. Τα αποτελέσματα της μελέτης μας δείχνουν μία πιθανή συσχέτιση μεταξύ ανώμαλης μεθυλίωσης του DNA και των διαταραχών την αποτύπωσης σε πλακούντες κυήσεων με ενδομήτρια υπολειπόμενη ανάπτυξη. Η μεταγραφή, η αποτύπωση και η μεθυλίωση είναι τρεις μοριακοί μηχανισμοί που προφανώς σχετίζονται, αλλά πιθανότατα μεσολαβούν και άλλες διεργασίες σε αυτή την αλυσίδα φαινομένων. Εφόσον οι επιγενετικοί μηχανισμοί που ελέγχουν την έκφραση των γονιδίων αποτύπωσης στον πλακούντα δεν είναι προφανείς, είναι αναγκαίες περισσότερες μελέτες για να διερευνηθεί ο ρόλος των γονιδίων αποτύπωσης στην παθοφυσιολογία των διαταραχών της εμβρυϊκής ανάπτυξης. (EL)
Introduction Intrauterine Growth Restriction (IUGR) is a pathological reduction in an expected pattern of fetal growth that leads to attenuation of fetal growth potential due to an insult that has occurred in utero. The causes of IUGR are not well understood. Several clinical and pathologic etiological classification systems have been proposed. All of them highlight the 3 compartments of pregnancy, i.e. fetal, maternal and placental. But none of these classification systems has led to the elucidation of the basic mechanisms of SGA/IUGR. A variety of studies demonstrated that IUGR is often attributed to a broad and vaguely-defined condition called “placental insufficiency”. Νo molecular diagnostic markers have been indentified to date, to detect fetuses that are at increased risk of developing IUGR later in pregnancy. Imprinted genes are recognized to be involved in regulating definite placental growth, development and function and therefore considered suitable candidates for a role in IUGR. Genomic imprinting is the preferential silencing of one copy of an autosomal gene while the other copy is expressed. This parent-of-origin-specific expression is regulated by epigenetic modifications, such as DNA methylation. A large proportion of imprinted genes is expressed in the placenta and affects the growth, morphology and nutrient transfer capacity of the placental exchange barrier. Imprinted genes that are paternally expressed (maternally imprinted) promote growth of the fetus, whilst maternally expressed (paternally imprinted) 19 genes act as growth suppressor to assure appropriate allocation of limited maternal resources to each offspring. IGF2 and H19, represent two oppositely expressed genes located adjacent to each other at 11p15.5, that share the same transcription regulatory epigenetic mechanisms and have an important role in feto-placental development. Research on IGF2/H19 imprinting has revealed complicated regulatory mechanisms including multiple enhancers, silencers, and boundary elements. Many studies have implicated specific regions of differential DNA methylation as critical for correct allelic expression of these imprinted genes. In most human tissues the imprinting of IGF2/H19 depends upon a differentially methylated region DMR which is located upstream of H19 promoters. This region functions as a methylation-sensitive insulator that binds to a CCCTC factor (CTCF) on the unmethylated maternal allele which prevents the interaction of IGF2 with enhancers located downstream of H19, partitioning the two alleles into transcriptionally ‘silent’ and ‘active’. Maternal IGF2 is silenced because CTCF preferentially binds to the unmethylated maternal allele, while methylation on the paternal allele prevents binding, thus allowing enhancers asses IGF2 promoter and expression of the paternal IGF2. Two other differentially methylated regions exist. H19 promoter and IGF2 DMR, are also located in this area and are paternally methylated. The implication of IGF2 and H19 with congenital growth syndromes motivated us to examine the possible relation of IGF2/H19 expression, imprinting and methylation patterns in placentas deriving from pregnancies complicated with fetal growth restriction. Aberrant DNA methylation which can modify imprinted genes expression may provide an attractive mechanism linking environmental causes to placental insufficiency and subsequently development of fetal growth 20 restriction. With the aim to clarify the role of the imprinted IGF2 and H19 in the pathogenesis of IUGR, we sought to determine whether altered IGF2 or H19 expression might correlate with relaxed imprinting in IUGR placentas. We also examined the epigenetic profiles of the IGF2/H19 domain in these tissues to determine if deregulated methylation status correlated with IGF2/H19 expression and potential imprinting deregulation. We postulated that altered epigenetic mechanisms may affect IGF2/H19 imprinting and deregulate their expression leading to IUGR. Materials and Methods Placentas were obtained after vaginal deliveries or caesarean sections from 31 women with singleton pregnancies that where complicated with IUGR and 17 normal pregnancies. Estimated Fetal Weight (EFW) was below the 5th percecentile and all pregnancies also demonstrated sonographic features of IUGR. Control placentas were obtained from pregnancies with appropriate-for-gestational-age (AGA) term fetuses with, birth weight (BW)>10th percentile and no other pregnancy complications. Genomic DNA was extracted from IUGR and normal placentas using the phenol/chloroform protocol, as previously described. Tissue specimens were homogenized in TRIzol® reagent and total RNA was extracted. RNA concentration was calculated with an UV spectrophotometer. Reverse transcription reactions for the preparation were performed. The mRNA expression of IGF2 and H19 was measured using a real-time RT-PCR assay with SYBR® Green I. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was used as an internal control to normalize IGF2 and H19 mRNA expression levels. Three sets of primers for IGF2 and one set for H19 were used. 21 Genotypes of IUGR tissues for three potential IGF2 polymorphisms and two potential H19 polymorphisms were determined by PCR of genomic DNA. The PCR products were examined by electrophoresis in a 3% agarose gel or on 5% polyacrylamide-urea gel and photographed on an ultraviolet light transilluminator. Determination of two genotype polymorphisms required restriction enzyme digestion (Apa I, Alu I). Sodium bisulfite conversion and MethyLight analysis were performed as previously described. Briefly two sets of primers and probes, designed specifically for bisulfite-converted DNA, have been used: a methylated set for the gene of interest and a reference set (COL2A1) to normalize for input DNA. The percentage of fully methylated molecules at a specific locus were calculated by dividing the GENE:COL2A1 ratio of a sample by the GENE:COL2A1 ratio of the SssI-treated human white blood cell DNA and multiplied by 100. The abbreviation PMR (Percentage of Methylated Reference) indicates this measurement. Results We analysed 31 placental samples from IUGR-complicated and 17 samples from normal pregnancies. BW was below the 5th percentile in all IUGR pregnancies and between the 10th and 90th percentile in the control group. The distributions of maternal age, weight, BMI, fetal gender, parity and smoking were well balanced between the two groups. As expected, there were significant differences between gestational age, birth weight and birth weight percentiles in IUGR subjects versus controls. Three IGF2 exon 9 polymorphisms and one H19 exon 5 polymorphisms were evaluated in this study. Two polymorphisms involved the creation of a restriction enzyme site, the other two involved a 19 bp deletion and a 4 bp 22 insertion in IGF2 exon 9. In total 16 out of 31 placental IUGR samples were informative (heterozygous) for IGF2 and 14 were informative for H19. Out of 17 control placentas IGF2 and H19 informative samples were 9 and 8 respectively. Of the total 25 informative cases of IGF2, loss of imprinting was shown in 9 specimens, all of which were IUGR samples. IGF2 transcripts derived from FGR placentas were down-regulated compared to controls (P=0.01) (Figure 2a). Placental expression levels of H19 were significantly increased in the FGR group (P=0.04). A linear regression analysis did not reveal a relationship between IGF2 and H19 expression and any of the covariates including BW percentile, gestational age at birth, and maternal characteristics. Nine FGR samples that demonstrated LOI for IGF2 showed decreased mRNA expression compared to FGR samples that maintained the imprinting pattern; however, this decrease was not significant. Methylation status of a region from 6156 to 6245 bp upstream of the H19 transcription start site was examined. The particular site contains the sixth of seven of CTCF-binding sites and coordinates IGF2 and H19 reciprocal expression [11]. Compared with methylation values of normal those from growth-restricted pregnancies had lower PMR, (mean value 27.4% vs. 36.2%, P=0.15). PMR measurements of the specific region were not associated with BW percentiles, BW or gestational age in linear regression analysis. No correlation was also noted between the H19 DMR methylation levels and IGF2 neither H19 expression. A MethyLight qPCR assay was developed to determine the methylation status of regions that control imprinted genes transcription. We subsequently measured the Percentage of Methylated Reference (PMR) of three different potential DMR’s. IGF2 exon 2/3 region demonstrated mean PMR values of 23.3% and 29.6%, for the IUGR and normal placentas respectively, a difference that was 23 marginally significant (P=0.05). The region from 7705 to 7809 bp close to the H19 promoter was also assessed with respect to the methylation status. Samples from growth restricted pregnancies displayed significantly lower methylation levels compared to normal placentas with mean values of 22.3% and 32.4% respectively (P=0.02) Conclusions The results from our study enhance the established association of the reduced IGF2 expression and fetal growth restriction. Reduced IGF2 mRNA levels in the growth restricted placentas is a finding that has been already reported in both humans and animals. We could not reproduce an observation made in the study by Guo et al, which advocated a significant correlation between the relative expression level of IGF2 in placenta and birthweight percentile. Since IGF2 and H19 are two oppositely imprinted genes, we were anticipating that reduced IGF2 mRNA levels will be accompanied by elevated H19 transcription in IUGR placentas. Indeed, placentas obtained from FGR-affected pregnancies demonstrated increased H19 expression in our study. To the best of our knowledge this is a novel finding, with yet undetermined importance. Even if evidence exists that associates H19 transcription with other placental abnormalities such as gestational trophoblastic disease, no definite conclusions can be drawn for the exact role of H19 expression on placental function and fetal growth. Since IGF2 expression is coordinately regulated with the maternally expressed H19, we focused our analysis on the ratio of mRNA from these two genes, comparing IUGR to non-IUGR placentas. IGF2/H19 mRNA ratio did not vary between the two groups. 24 Bilallelic expression of IGF2 was established in 9 out of 16 informative IUGR. Similar results have been reported in a study that evaluated biallelic expression of H19 in normal and preeclamptic placentas. LOI was only observed in preeclamptic placentas and was also correlated with the severity of the disease. Likewise relaxation of IGF2 imprinting was noted only in tissues with gestational trophoblastic disease whereas none of the normal placentas demonstrated such phenomenon. . IUGR samples that displayed LOI had similar IGF2 and H19 mRNA levels to control samples that revealed normal imprinting. In our study we have evaluated the methylation patterns of the ICR domain and at the H19 and IGF2 promoter region. ICR hypomethylation is thought to be responsible for the low birth weight and poor post-natal growth observed in SRS patients. Although PMR values were lower in the FGR group, in all DMRs studied statistical difference was shown only in the H19 promoter region. Methylation levels in the FGR placentas were lower in the CTCF binding site associated with SRS; however, the difference was not significant. Mean PMR values in the FGR group are similar to those reported by Bourque et al in the same region, 27.4% and 30.8%, respectively. Hypomethylation of the H19 promoter region has been shown in the FGR group. Reduced methylation levels at the same region were also reported in small for gestational age placentas. Hypomethylation in the promoter region of a gene is generally associated with increased gene expression. Hence the reduced PMR values in the FGR group that we have found is in consistency with the increased H19 mRNA levels. There was no correlation, however, between PMR and mRNA levels. Several conclusions can be drawn and also several questions can be raised from this study. An abnormal biallelic expression of imprinted genes in 25 placentas is a finding that has been reported in cases of abnormal placentation such as preeclampsia and gestational trophoblastic disease. We hypothesize that in FGR cases the placenta responds to chronic hypoperfusion by activating a program of gene expression via genomic imprinting. IGF2 LOI may represent an effort made by the placenta to compensate its reduced functional capacity by leading to a biallelic production of a potent growth factor. The increased H19 transcription in the FGR placentas is a finding that is compatible with its known implication in post-natal growth restricted syndromes. The hypomethylation of the H19 promoters is in accordance with the increased expression in the FGR placentas. However, whether these two events represent the component of a molecular mechanism which leads to FGR or merely the consequence of placental dysfunction is unknown. Since DNA methylation and imprinting are particularly susceptible to environmental changes, imprinted genes may respond to placental hypoperfusion, by activating altered imprinting and methylation programs. Evidence provided from the present study may serve as a stimulus for larger studies that will elucidate the role of IGF2 and H19 in intrauterine growth restriction. (EN)

Τύπος Εργασίας--Διδακτορικές διατριβές
text

H19
Placenta
IUGR
Ενδομήτρια υπολειπόμενη ανάπτυξη
Πλακούντας
IGF2
Γονίδια αποτύπωσης
Μεθυλίωση
Methylation
Obstetrics
Imprinted genes

Πανεπιστήμιο Κρήτης (EL)
University of Crete (EN)

Ελληνική γλώσσα

2011-07-15


Σχολή/Τμήμα--Ιατρική Σχολή--Τμήμα Ιατρικής--Διδακτορικές διατριβές



*Η εύρυθμη και αδιάλειπτη λειτουργία των διαδικτυακών διευθύνσεων των συλλογών (ψηφιακό αρχείο, καρτέλα τεκμηρίου στο αποθετήριο) είναι αποκλειστική ευθύνη των αντίστοιχων Φορέων περιεχομένου.