Biochemical and biophysical chracterization of the sturctural domains of the putative polycaccharide deacetylases BAO330 from Bacillus anthracis.

 
This item is provided by the institution :
University of Crete
Repository :
E-Locus Institutional Repository
see the original item page
in the repository's web site and access all digital files if the item*
share




2015 (EN)
Βιοχημικός και βιοφυσικός χαρακτηρισμός των διακριτών δομικών περιοχών της πιθανής απακετυλάσης πολυσακχαρίτων BAO330 από Bacillus anthracis
Biochemical and biophysical chracterization of the sturctural domains of the putative polycaccharide deacetylases BAO330 from Bacillus anthracis.

Μακράκη, Ελένη Κ.

Μπουριώτης, Βασίλης

Η λιποπρωτεΐνη ΒΑ0330 αποτελεί μια από τις 11 πιθανές απακετυλάσες πολυσακχαριτών του Bacillus anthracis. Πρόσφατα απεδείχθη ο δομικός της ρόλος στη σταθεροποίηση του κυτταρικού τοιχώματος του βακτηρίου. Η ΒΑ0330 αλληλεπιδρά με πεπτιδογλυκάνη και συμβάλλει σημαντικά στη προσαρμογή του βακτηρίου σε συνθήκες υψηλής αλατότητας. Η επίλυση της δομής της αποκάλυψε μια καρβοξυτελική περιοχή που φέρει τη τυπική αναδίπλωση πρωτεϊνών της ομάδας CE4 (NodB) και μια αμινοτελική περιοχή που δομικά μοιάζει με την επικράτεια φιμπρονεκτίνης τύπου-3. Μέχρι σήμερα δεν έχει ανιχνευτεί ενεργότητα της ΒΑ0330 σε συνήθη υποστρώματα απακετυλασών πολυσακχαριτών. Ο βιοχημικός και βιοφυσικός χαρακτηρισμός αυτών των διακριτών δομικών περιοχών της ΒΑ0330 αποτέλεσε το αντικείμενο μελέτης της συγκεκριμένης εργασίας. Πραγματοποιήθηκε έκφραση των επιμέρους αυτών δομικών περιοχών ΒΑ0330(FN3) και BA0330(NODB) στο ετερογενές σύστημα έκφρασης της Ε.coli και απομόνωση της διαλυτής επικράτειας BA0330(FN3) σε δύο χρωματογραφικά στάδια (προσροφητής «Ni-NTA agarose», προσροφητής Sephacryl S100). Συνοψίζοντας τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής η επικράτεια φιμπρονεκτίνης τύπου-3, BA0330(FN3), έπειτα από χρήση της μεθόδου του κυκλικού διχρωισμού (CD), φαίνεται να παρουσιάζει υψηλό σημείο τήξης και μια εντελώς αναστρέψιμη μορφή μετά από θέρμανση στους 90οC και εν συνεχεία ψύξη πίσω στους 10οC, ενω παράλληλα διατηρεί υψηλό το ποσοστό των β-φύλλων στη δευτεροταγή της δομή, σημαντική ένδειξη ανεξάρτητης αναδίπλωσής της από την υπόλοιπη αλληλουχία της ΒΑ0330. Αρχικά πειράματα, δείχνουν αλληλεπίδραση της ΒΑ0330(FN3) με την πεπτιδογλυκάνη καθιστώντας υπεύθυνη τη συγκεκριμένη επικράτεια για την αλληλεπίδραση της ΒΑ0330 με το ίδιο υπόστρωμα. Η ανάλυση της ΒΑ0330 με σκέδασης φωτός πολλαπλών γωνιών (Multi-angle light scattering, MALS) έδειξε τη διατήρησή της σε ένα μοναδιαίο πληθυσμό μονομερούς χωρίς να αποδεικνύεται καμία επίδραση της ιοντικής ισχύς στο πρότυπο ολιγομερισμού. Τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας παρέχουν σημαντικές πληροφορίες σχετικά με το ρόλο της επικράτειας φιμπρονεκτίνης τύπου-3 στη λειτουργία της ΒΑ0330 συμβάλλοντας στη διαλεύκανση της λειτουργίας της για την περαιτέρω κατανόηση της παθοφυσιολογίας του παθογόνου βακτηρίου Bacillus anthracis. (EL)
The lipoprotein BA0330 is one of 11 putative polysaccharide deacetylases in Bacillus anthracis. Recently, the structural role of BA0330 in maintaining the integrity of the cell wall of the bacterium was demonstrated. BA0330 interacts with peptidoglycan and contributes to the adaptation of B. anthracis to high salt stress. The structure determination of BA0330 revealed the presence of an N-terminal fibronectin type-3 (FN3) domain and a carboxyterminal catalytic domain (NodB). BA0330 lacked de-N-acetylase activity against common polysaccharide deacetylase substrates. In this study we performed biochemical and biophysical analysis of the distinct structural domains of BA0330. ba0330(fn3) and ba0330(nodb) were expressed in E.coli and recombinant BA0330(FN3) was isolated employing two chromatographic steps (Ni-NTA agarose, Sephacryl S100). Summarizing the results of this study we demonstrated that the N-terminal fibronectin type-3 (FN3) domain, BA0330(FN3) exhibit a high melting point and a completely reversible form after heating at 90οC and then cooling back to 10οC. It seems that it can be fold independently from the catalytic domain maintaining mainly β-sheets in the secondary structure. Initial results demonstrated that BA0330(FN3) contributes to the interaction of BA0330 with peptidoglycan. The analysis of BA0330(FN3) by Multi-angle light scattering (MALS) revealed the maintenance of the domain in one population as monomer while no effect of ionic strength on oligomerization was observed. The results of this study provide important information on the role of fibronectin type-3 (FN3) domain in the function of the native BA0330 and contributes to further understanding of the pathophysiology of the pathogenic bacterium Bacillus anthracis. (EN)

text
Τύπος Εργασίας--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης

FN3
Fibronectin type-3
Φιμπρονεκτίνη τύπου-3

Πανεπιστήμιο Κρήτης (EL)
University of Crete (EN)

Greek

2015-11-20


Σχολή/Τμήμα--Σχολή Θετικών και Τεχνολογικών Επιστημών--Τμήμα Βιολογίας--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης



*Institutions are responsible for keeping their URLs functional (digital file, item page in repository site)