Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκε η in-vivo τοξικότητα του ανα-βολικού στεροειδούς, νανδρολόνης στο καρδιαγγειακό σύστημα. Πιο συγκεκριμένα, αξιολογήθηκε η επίδραση της παρατεταμένης χρήσης του συνηθέστερα χρησιμοποι-ούμενου ενέσιμου εστέρα της νανδρολόνης, του δεκανοϊκού (nandrolone decanoate) στο καρδιαγγειακό σύστημα πειραματόζωων, τόσο σε μακροσκοπικό, όσο και σε κυτταρικό επίπεδο. Ακόμα μελετήθηκε η αντιστρεψιμότητα ή μη των τυχόν παρενερ-γειών της αναβολικής ουσίας μετά από χρονικό διάστημα αποτοξίνωσης (wash-out period, 4 μήνες). Για την επίτευξη των ανωτέρω, πραγματοποιήθηκε υπερηχογραφι-κός έλεγχος καθώς και ιστολογικός έλεγχος, του καρδιακού ιστού των πειραματόζω-ων. Συνάμα, πραγματοποιήθηκε προσδιορισμός της ενεργότητας της τελομεράσης στα μονοκύτταρα περιφερικού αίματος και στον καρδιακό ιστό, όπως επίσης μέτρηση βιοχημικών δεικτών και οξειδωτικού στρες στο αίμα. Επιπρόσθετα, αναπτύχθηκε α-ναλυτική μέθοδος για τον προσδιορισμό της μητρικής ουσίας, αλλά και των μεταβολι-τών της σε βιολογικά δείγματα (ούρα, τρίχα) προερχόμενα από τα πειραματόζωα.
Παράλληλα, με τη μελέτη της τοξικής δράσης της νανδρολόνης στην καρδιά, έγινε έλεγχος της πιθανής τοξικής δράσης του αναβολικού στους νεφρούς. Για το σκοπό αυτό, έγινε ιστολογική εκτίμηση των νεφρών, μέτρηση της ενεργότητας της τελομεράσης στους νεφρούς, μέτρηση οξειδωτικού στρες στους νεφρούς και μέτρηση βιοχημικών δεικτών που σχετίζονται με τη λειτουργία των νεφρών.
Τα Αναβολικά Ανδρογόνα Στεροειδή (ΑΑΣ) αποτελούν συνθετικά παράγωγα της φυσικής ορμόνης τεστοστερόνης και ασκούν δύο βασικές λειτουργίες, προάγουν την ανάπτυξη του ανδρικού αναπαραγωγικού συστήματος και τη μυϊκή αύξηση. Πα-ρόλο που τα ΑΑΣ χρησιμοποιούνται σε διάφορες καταστάσεις ως θεραπευτική αγω-γή, γρήγορα ακολούθησε η μη ιατρική χρήση τους, με σκοπό τη βελτίωση της αγω-νιστικής ικανότητας η οποία αρχικά αφορούσε αθλητές της άρσης βαρών, αλλά και αθλημάτων που απαιτούν αυξημένη μυϊκή δύναμη. Στις μέρες μας, παρά το γεγονός ότι τα ΑΑΣ ανήκουν στη λίστα των απαγορευμένων ουσιών της W.A.D.A (World Antidoping Agency), αποτελούν την ηγετική ομάδα των θετικών αποτελεσμάτων κατά τους ελέγχους doping.
Ιδιαίτερο χαρακτηριστικό των τελευταίων χρόνων, είναι ότι η κατάχρηση των αναβολικών ουσιών έχει αυξηθεί ραγδαία και έχει εξαπλωθεί σε χώρους πέρα του αθλητικού, για λόγους κοινωνικούς (π.χ για λόγους ψυχαγωγίας σε συνδυασμό με αλκοόλ) και κοσμητικούς (π.χ βελτίωση εξωτερικής εμφάνισης, απόκτηση μυώδους σωματότυπου). Ένα ακόμα ανησυχητικό στοιχείο είναι ότι οι δόσεις που λαμβάνουν οι χρήστες γίνονται όλο και μεγαλύτερες με τα χρόνια. Αναφέρεται πως οι δόσεις που λαμβάνουν οι αθλητές με σκοπό τη βελτίωση της απόδοσής τους είναι από 10 έως 100 φορές μεγαλύτερη από τις αποδεκτές για θεραπευτικούς λόγους.
Παρότι η νανδρολόνη συντέθηκε στις αρχές της δεκαετίας του 1950, αποτελεί ένα από τα πλέον χρησιμοποιούμενα αναβολικά στεροειδή στο χώρο του αθλητι-σμού, ενώ κλινικά εφαρμόζεται σε καταβολικές καταστάσεις, όπως σοβαρά εγκαύμα-τα, καρκίνο και AIDS, καθώς επίσης στην απλαστική αναιμία, στη χρόνια ηπατική α-νεπάρκεια και στην οστεοπόρωση. Η δομή της είναι παρόμοια με αυτήν της τεστο-στερόνης, με τη μόνη διαφορά την απουσία της μεθυλομάδας στη θέση 19 και έτσι χαρακτηρίζεται ως 19-νορτεστοστερόνη. Η νανδρολόνη συναντάται είτε υπό τη μορ-φή ενέσιμων εστέρων της, είτε ως προορμόνες χορηγούμενες από το στόμα. Όλες οι μορφές της νανδρολόνης μετατρέπονται σχεδόν ολοκληρωτικά σε μεταβολίτες της φάσης Ι και εκκρίνονται ως συζεύγματα της νορανδροστερόνης (3α-υδροξυ-5α-εστραν-17-όνη) και νορετιοχολανολόνης (3α-υδροξυ-5β-εστραν-17-όνη).
Για τη διεξαγωγή του in vivo πειράματος χρησιμοποιήθηκαν πειραματόζωα (κουνέλια) ίδιας ηλικίας και ίδιου φύλου. Τα πειραματόζωα χωρίστηκαν σε 4 ομάδες: Control, High dose Intramuscular (HDIM), Low dose Intramuscular (LDIM) και High Dose Subcutaneous (HDSC). Στα πειραματόζωα των ομάδων HDIM και HDSC η χο-ρηγούμενη δόση ήταν 10 mg/kg και στα πειραματόζωα της ομάδας LDIM η χορηγού-μενη δόση ήταν 4 mg/kg, δύο ημέρες την εβδομάδα για 6 μήνες. Το πειραματικό σχήμα της χορήγησης επιλέχθηκε με τέτοιο τρόπο ώστε να προσομοιώνει τη χρήση από τους αθλητές. Αποτελείται από δύο περιόδους, την περίοδο χορήγησης που διήρκεσε 6 μήνες και το διάστημα της αποτοξίνωσης (wash-out period) που διήρκεσε 4 μήνες. Κατά τη διάρκεια του πειράματος, συλλέχθηκαν βιολογικά δείγματα (αίμα, τρίχα, ούρα) στην αρχή του πειράματος και στο τέλος κάθε διμήνου χορήγησης και αποτοξίνωσης. Το αίμα χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των βιοχημικών δει-κτών, της ενεργότητας της τελομεράσης και των δεικτών του οξειδωτικού στρες. Τα ούρα χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη του μεταβολισμού και η τρίχα για τη μελέτη της πιθανής εναπόθεσης στον οργανισμό.
Για την ανίχνευση της αναβολικής ουσίας και των μεταβολιτών της στη τρίχα και στα ούρα αναπτύχθηκε αναλυτική μέθοδος υγροχρωματογραφίας συζευγμένης με φασματομετρία μαζών (LC-MS). H ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε στήλη Discovery HS C18 (25cm x 4.6cm x 5μm), η κινητή φάση αποτελούνταν από 0, 1% φορμικό οξύ και μεθανόλη (gradient) και πηγή χημικού ιονισμού υπό ατμοσφαιρική πίεση (APCI), σε ρύθμιση θετικού ιονισμού. Για την αξιολόγηση αυτής χρησιμοποιήθηκαν οι αναλυ-τικές παράμετροι: γραμμικότητα, ακρίβεια, ανάκτηση, επαναληψιμότητα, όριο ανί-χνευσης (LOD) και όριο ποσοτικοποίησης (LOQ). Ο χρόνος έκλουσης της νανδρολό-νης ήταν 14,93 min και τα ιόντα που εξετάσθηκαν ήταν 275,15 and 307,25. Για το μεταβολίτη 19-ΝΕ και το 19-ΝΑ ο χρόνος ανάσχεσης ήταν 16,13 min και 16,33 αντί-στοιχα, ενώ τα ιόντα που εξετάσθηκααν ήταν 259,25 και 241,10. Ο χρόνος ανάσχε-σης του turinabol (I.STD) ήταν 15.73 min και τα ιόντα που εξετάσθηκαν ήταν 317.73 και 335.25.
Στα δείγματα τρίχας, το όριο ανίχνευσης (LOD) της μεθόδου, για τη μητρική ουσία, ήταν 1,2 pg/mg, ενώ για τους δύο κύριους μεταβολίτες 19-ΝΕκαι 19-ΝΑ ήταν 2,8 pg/mg και 6,2 pg/mg αντίστοιχα. Το όριο ποσοτικοποίησης (LOQ) για τη μητρική ουσία, ήταν 4,0 pg/mg, ενώ για τους δύο κύριους μεταβολίτες 19-ΝΕ και 19-ΝΑ ήταν 9.3 pg/mg και 20,8 pg/mg, αντίστοιχα. Στα δείγματα τρίχας, η μέση ανάκτηση της νανδρολόνης βρέθηκε 92%, ενώ των μεταβολιτών 119%. Η ακρίβεια (accuracy) της μεθόδου στα δείγματα τρίχας, ήταν για τη νανδρολόνη 99%, για τη 19-ΝΕ 98% και για τη 19-ΝΑ 102%. Η επαναληψιμότητα (precision) εκφρασμένη σε %RSD στα δείγ-ματα τρίχας ήταν 14% για τη νανδρολόνη, 29% για τη 19-ΝΕ και 17% για τη 19-ΝΑ. Η γραμμικότητα της μεθόδου ήταν ικανοποιητική τόσο για τη μητρική ουσία όσο για τους μεταβολίτες (&γτ0,99) στο εύρος συγκεντρώσεων που μελετήθηκαν (0-1000 pg/mg). Σε δείγματα τρίχας προερχόμενα από τα πειραματόζωα βρέθηκε μόνο η μη-τρική ουσία: η μέση συγκέντρωση της οποίας για την ομάδα υψηλής δόσης ήταν 33,9±5,9 pg/mg ενώ η μέση συγκέντρωση για την ομάδα χαμηλής δόσης ήταν 26,7±1,0 pg/mg.
Στα δείγματα ούρων, το όριο ανίχνευσης (LOD) της μεθόδου, για τη μητρική ουσία, ήταν 0,9 ng/ml, ενώ για τους δύο κύριους μεταβολίτες 19-νορετιοχολανολόνη και 19-νορανδροστερόνη 1,8 ng/ml και 1,7 ng/ml αντίστοιχα. Το όριο ποσοτικοποίη-σης (LOQ) της μεθόδου, για τη μητρική ουσία, ήταν 3,1 ng/ml, ενώ για τους δύο κύρι-ους μεταβολίτες 19-ΝΕ και 19-ΝΑ 8,7 ng/ml και 5,5 ng/ml, αντίστοιχα. Η μέση ανά-κτηση της νανδρολόνης βρέθηκε 75%, του μεταβολίτη 19-νορετιοχολανολόνη 101% και του 19-νορανδροστερόνη 114%. Η ακρίβεια (accuracy) της μεθόδου στα δείγματα ούρων, ήταν για τη νανδρολόνη 104%, για τη 19-νορετιοχολανολόνη 93% και για τη 19-νορανδροστερόνη 98%. Το %RSD στα δείγματα τρίχας ήταν 27% για τη νανδρο-λόνη, 25% για τη 19-ΝΕ και 30% για τη 19-ΝΑ. Η γραμμικότητα της μεθόδου ήταν ικανοποιητική τόσο για τη μητρική ουσία όσο για τους μεταβολίτες (΄&γτ0,99) στο εύρος συγκεντρώσεων που μελετήθηκαν (0-1000 ng/ml). Σε δείγματα ούρων προερχόμενα από τα πειραματόζωα βρέθηκαν μόνο οι μεταβολίτες της νανδρολόνης, για την ομά-δα υψηλής δόσης η μέση συγκέντρωση της 19-ΝΕ ήταν 6,9± 4,0 ng/ml και αντίστοι-χα, η μέση συγκέντρωση της 19-ΝΑ ήταν 8,9±4.5 ng/ml. Για την ομάδα χαμηλής δό-σης η μέση συγκέντρωση της 19-ΝΕ ήταν 1,6±0,5 ng/ml και η μέση συγκέντρωση της 19-ΝΑ ήταν 11,7± 2,9 ng/ml. Κατά την ιστολογική εκτίμηση του καρδιακού ιστού παρατηρήθηκε εστιακή ί-νωση και ήπια χρόνια φλεγμονή στις ομάδες υψηλής δόσης (HDIM, HDSC). Επιπλέ-ον, στην HDSC ομάδα παρατηρήθηκε οίδημα. Αντίθετα, ήπια εστιακή ίνωση παρα-τηρήθηκε στην ομάδα χαμηλής δόσης (LDIM). Δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημα-ντικές αλλαγές, τόσο στο βάρος της καρδιάς, όσο και στο συνολικό βάρος του σώμα-τος των πειραματόζωων στα οποία χορηγούνταν η αναβολική ουσία (p΄&γτ0,05).
Στα πειραματόζωα στα οποία πραγματοποιήθηκε η χορήγηση της αναβολικής ουσίας παρατηρήθηκε μια τάση για μη σημαντικές αυξημένες τιμές της μάζας του μυοκαρδίου (p=0,340) η οποία συνδέθηκε με επιδείνωση των δεικτών της ολικής μυ-οκαρδιακής λειτουργίας (MPI-PW: treated animals 0,73±0,16 vs control group 0,52±0,07, p=0,026; MPI-TDI: treated animals 0,91±0,09 vs control group 0,63±0,02, p=0,001). Η συστολική λειτουργία δεν παρουσίασε αλλαγές ή τάση για επιδείνωση στα πειραματόζωα στα οποία έγινε η χορήγηση. Επιπλέον, στα πειραματόζωα στα οποία χορηγήθηκε υψηλή δόση αναβολικής ουσίας παρουσίασαν πιο έκδηλη αύξηση στη μάζα του μυοκαρδίου (myocardial mass-mmode: high-dose treated animals 6,0±1,4 g vs low-dose treated animals 4,9±0,31 g, p=0,343) όπως επίσης και πιο σημαντική επιδείνωση στους δείκτες της ολικής μυοκαρδιακής λειτουργίας, σε σχέση με τα πειραματόζωα χαμηλής δόσης.
Πραγματοποιήθηκε ακόμα μέτρηση των δεικτών του οξειδωτικού στρες (TBARS, carbonyls, TAC, catalase). Παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση των επιπέ-δων των TBARS (p΄&λτ0,05) στις δύο ομάδες υψηλής δόσης (HDIM, HDSC) και μη ση-μαντική μείωση των επιπέδων της καταλάσης (p=0,237, p=0,238 αντίστοιχα). Ιδιαίτε-ρο ενδιαφέρον έχει το γεγονός ότι κατά τη διάρκεια της περιόδου αποτοξίνωσης τα επίπεδα των TBARS και της καταλάσης επέστρεψαν στα φυσιολογικά επίπεδα στην ομάδα HDIM, ενώ στην ομάδα HDSC, παρότι τα επίπεδα της καταλάσης επέστρεψαν σε φυσιολογικά επίπεδα, τα επίπεδα των TBARS αυξήθηκαν σημαντικά (p=0,01). Στην ομάδα χαμηλής δόσης (LDIM) τα επίπεδα των δεικτών του οξειδωτικού στρες παρέμειναν πρακτικά σταθερά. Στα επίπεδα των carbonyls και TAC δε παρουσιά-σθηκε καμία σημαντική διαφοροποίηση σε καμία ομάδα χορήγησης.
Από τη μέτρηση της ενεργότητας της τελομεράσης στον καρδιακό ιστό διαπι-στώθηκε πως κατά τη διάρκεια της περιόδου χορήγησης η σχετική ενεργότητα της τελομέρασης, αυξήθηκε σημαντικά σε όλες τις ομάδες χορήγησης (LDIM 230% vs HDIM 552%, p=0,004; HDSC 212%). Ο ενδομυϊκός τρόπος χορήγησης ίσως συμ-βάλλει στην αύξηση της φλεγμονής, όπως φαίνεται από τη σχετική ενεργότητα της τελομεράσης στα μονοκύτταρα του περιφερικού αίματος (ΗDIM 652% vs HDSC 312%, p=0,003; LDIM 330% vs HDSC 312%, p=0,20). Κατά το διάστημα της αποτο- ξίνωσης δε παρατηρείται επιστροφή των τιμών στα φυσιολογικά επίπεδα σε καμία από τις δύο ομάδες υψηλής δόσης (p΄&λτ0,05).
Παράλληλα μετρήθηκαν τα επίπεδα βιοχημικών δεικτών που σχετίζονται με τη καρδιαγγειακή λειτουργία. Παρατηρήθηκε μη σημαντική (p΄&γτ0,05) αύξηση των επι-πέδων της CPK σε όλες τις ομάδες χορήγησης (control: 332±253 U/L, LDIM: 645±442 U/L, HDIM: 1149±733 U/L, HDSC: 461±314 U/L) και ταυτόχρονα μια ήπια αύξηση των επιπέδων LDH στις ομάδες ενδομυϊκής χορήγησης. Παρατηρήθηκε ση-μαντική αύξηση των επιπέδων της Τροπονίνης Ι στην ομάδα HDSC (p=0,024) κατά τη διάρκεια της περιόδου χορήγησης. Αυξημένα επίπεδα Τροπονίνης Ι παρατηρήθη-καν και κατά τη διάρκεια της περιόδου αποτοξίνωσης για την προαναφερθείσα ομά-δα καθώς επίσης παρατηρήθηκε μια απότομη αύξηση στα επίπεδα του BNP (7,3±3,6 pg/mg).
Στο πλαίσιο της μελέτης της νεφροτοξικότητας η ιστολογική εκτίμηση των νε-φρών έδειξε για την ομάδα HDIM υπεραιμία στα σπειράματα και στον ενδιάμεσο χώ-ρο των ουροφόρων σωληναρίων. Επίσης παρατηρήθηκε εστιακή ίνωση και ήπια διάμεση φλεγμονή. Στην ομάδα LDIM παρατηρήθηκε υπεραιμία και ήπια χρόνια φλεγμονή. Στην ομάδα HDSC παρατηρήθηκε υπεραιμία στον ενδιάμεσο χώρο των ουροφόρων σωληναρίων, αγγειακή συμφόρηση και αγγειοβρίθεια.
Επιπρόσθετα, μετρήθηκαν τα επίπεδα της ουρίας και της κρεατινίνης στον ορό προερχόμενο από τα πειραματόζωα. Οι δείκτες αυτοί αυξήθηκαν σε όλες τις ο-μάδες, με σημαντική διαφορά (p΄&λτ0.05) μόνο στις HD (ουρία: control: 13,8±6,4 ng/dl, LDIM: 20,0±5,7 ng/dl, HDIM: 21,6±9,1 ng/dl, HDSC: 16,7±7,3 ng/dl, κρεατινίνη: control: 0,37±0.37 mg/dl, LDIM: 0,46±0,27 mg/dl, HDIM: 0,55±0,27 mg/dl, HDSC: 0,36±0.26 mg/dl). Οι τιμές της κρεατινίνης για την ομάδα HDIM μειώθηκαν κατά την περίοδο της αποτοξίνωσης κατά 20%, ενώ οι τιμές της ουρίας αυξήθηκαν σημαντικά για τις ομάδες HDIM και HDSC (56%, p=0,034 and 21%, p=0,047, αντίστοιχα) και δεν παρουσιάσθηκε σημαντικές αλλαγές κατά την περίοδο της αποτοξίνωσης. Παρατη-ρήθηκε επίσης αλλαγή των δεικτών του οξειδωτικού στρες (TBARS, GSH) στον ιστό των νεφρών στις ομάδες HDIM και HDSC (control: TBARS: 17,7±4,6 nmol/mg protein, HDIM: 35,4±7,2 nmol/mg protein, HDSC: 42±29 nmol/mg protein, GSH: con-trol: 0,138±0,004 μmol/mg protein, HDIM: 0,063±0,020 μmol/mg protein, HDSC: 0,098±0,012 μmol/mg protein). Τα επίπεδα της GSH μειώθηκαν σημαντικά (p=0,018) κατά 50% στην ομάδα HDIM και κατά 29% στην ομάδα HDSC (p=0,046). Κατά τη διάρκεια της περιόδου αποτοξίνωσης τα επίπεδα των δεικτών του οξειδωτικού στρες παρέμειναν πρακτικά αμετάβλητα με μια μη σημαντική (p΄&γτ0,05) αύξηση των επιπέ-δων των TBARs και carbonyls στην ομάδα HDSC. Οι μετρήσεις της ενεργότητας της τελομεράσης στο νεφρικό ιστό έδειξαν ση-μαντική αύξηση μόνο στην ομάδα HDIM (p=0,020) στην περίοδο χορήγησης. Κατά το διάστημα της αποτοξίνωσης η σχετική ενεργότητα της τελομεράσης μειώθηκε μη ση-μαντικά στις ομάδες HDIM και HDSC (12% και 26%, αντίστοιχα).
Από τα παραπάνω αποτελέσματα φαίνεται πως η νανδρολόνη προκαλεί επιδείνωση στους βιοχημικούς δείκτες της νεφρικής λειτουργίας σε συνδυασμό με τις αλλοιώσεις στους νεφρούς, πιθανώς ως απόρροια αυξημένου οξειδωτικού στρες.
Το πρωτόκολλο αυτό αποτελεί μια καινοτόμα ερευνητική προσπάθεια στην μελέτη των παρενεργειών της κατάχρησης των αναβολικών στεροειδών, καθώς εξε-τάζει ποικίλες και πρωτοποριακές παραμέτρους ώστε να γίνει η εκτίμηση του βαθμού και του μηχανισμού της καρδιοτοξικότητας της νανδρολόνης. Συμπερασματικά, η παρατεταμένη χρήση της νανδρολόνης επηρεάζει την διαστολική λειτουργία, όπως αυτό φαίνεται από τους δείκτες της ολικής μυοκαρδιακής λειτουργίας. Η αύξηση των επιπέδων της τροπονίνης και του BNP αποτελεί σημαντική ένδειξη της έναρξης της καρδιακής ανεπάρκειας. Το γεγονός ότι παρατηρείται αύξηση της τροπονίνης κατά το διάστημα της αποτοξίνωσης αποτελεί μια ανησυχητική ένδειξη για παρατεταμένη ή καθυστερημένη τοξική δράση των αναβολικών στην καρδιά. Επιπλέον, τα ιστοπαθο-λογικά ευρήματα καταδεικνύουν την τοπική βλάβη του καρδιακού ιστού καθώς και η αυξημένη ενεργότητα της τελομεράσης πιθανότατα λειτουργεί ως αντισταθμιστικός μηχανισμός για την επιβίωση των κυττάρων μπροστά στην υπάρχουσα συσσώρευση του οξειδωτικού στρες. Ακόμα, από τα αποτελέσματα φαίνεται πως οι ομάδες υψηλής δόσης επιβαρύνονται περισσότερο από αυτήν της χαμηλής. Η ενδομυϊκή χορήγηση υψηλής δόσης φαίνεται πως επηρεάζει περισσότερο το καρδιαγγειακό σύστημα σε σχέση με την αντίστοιχη χαμηλής δόσης. Η υποδόρια χορήγηση όμως φαίνεται να προκαλεί πιο αμετάβλητες παρενέργειες στο καρδιαγγειακό σύστημα.
(EL)
In the present PhD thesis, the in-vivo toxicity of anabolic steroid, nandrolone on the cardiovascular system was studied. Specifically, we evaluated the effects of the prolonged use of the most commonly used injectable ester of nandrolone, (nan-drolone decanoate), on the cardiovascular system of the experimental animals, both at a macroscopic and cellular level. Furthermore, the possibility of reversible, or not, side effects from the anabolic substance after a time period of detoxification (wash-out period, 4 months) was additionally evaluated. To achieve the above, an ultra-sound scan as well as a histological estimation of the animal’s cardiac tissue was done. Besides the cardiological aspect, telomerase activity in peripheral blood mono-cytes and heart tissue, as well as measurements of biochemical indicators of oxida-tive stress in the blood were determined. To ensure these results, an analytical method was developed and applied to determine the parent compound and its me-tabolites in biological matrices (urine, hair) sampled from the study animals.
At the same time of the study, possible toxic effects on the kidney function was estimated conducting histological tests and measuring telomerase activity, oxi-dative stress indicators as well as kidney function biochemical markers.
Anabolic Androgenic Steroids (AAS) are synthetic derivatives of the natural hormone testosterone and exert two main functions, them being to promote the de-velopment of the male reproductive system and to enhance muscle growth. Although AAS was initially used in various situations as a medical treatment, non-medical use of AAS followed in order to improve athlete’s capabilities regarding weight lifting and sports that would require increased muscle strength. Νowdays, despite the fact that the AAS is a banned substance of W.A.D.A (World Antidoping Agency), they are still the leading group of positive results during doping control.
In the recent years, anabolic substance abuse has increased rapidly and has spread into areas beyond sports, such as for social (i.e. entertainment purposes in combination with alcohol) and cosmetic reasons (e.g. improved appearance, acquir-ing a muscular body type). Another interesting aspect is that the intake doses have increased over the years with doses taken by the athletes to be 10-100 times higher than the acceptable level needed for a therapeutic purpose.
Although nandrolone was synthesized in the early 1950s, it is one of the most used anabolic steroids in sports and clinically applied in catabolic states, such as se-vere burns, cancer, AIDS, aplastic anemia, chronic liver failure and osteoporosis. The chemical structure is similar to that of testosterone, with the only difference being the absence of the methyl group at position 19, thus characterized as 19-nortestosterone. Nandrolone is available either in the form of injectable esters, or as prohormones, administered orally. All forms of nandrolone are converted almost completely into phase I metabolites and excreted as conjugates of norandrosterone (3a-hydroxy-5a-estr-17-one, 19-NA) and noretiocholanolone (3a-hydroxy-5-estr-17-one, 19-NE).
The in vivo experiment consisted of rabbits of the same age and sex. The an-imals were divided into 4 groups: Control, High dose Intramuscular (HDIM), Low dose Intramuscular (LDIM) and High Dose Subcutaneous (HDSC). In the HDIM and HDSC groups the dose was 10 mg/kg and in the LDIM group the dose was 4 mg/kg, administered twice a week for a six-month period. The experimental scheme of ad-ministration was selected in such a way so as to simulate an athlete’s use. It consist-ed of two periods, the administration period that lasted six months and the period of detoxification (wash-out period) that lasted for four months. During the experiment, biological matrixes (blood, hair, urine) were collected at the start of the experiment and at the end of each two-month period of administration and detoxification. Sam-pled blood was used for estimating biochemical indicators, telomerase activity and oxidative stress markers, whereas urine was used to study the metabolism of AAS and hair was used to study possible deposition.
For the detection of nandrolone and its metabolites, in hair and urine, an ana-lytical method was developed based on liquid chromatography-mass spectrometry system (LC-MS). The analysis was conducted in a Discovery HS C18 (25cm x 4.6cm x 5μm) column, the mobile phase was gradient, consisting of 0.1% formic acid and methanol and APCI source was used. For the evaluation of the proposed methods, the following analytical parameters: linearity, accuracy, recovery, precision, LOD and LOQ were measured. The retention time for nandrolone was 14.93 min and the ex-amined ions were 275.15 and 307.25. The retention time for 19-NE was 16.13 min and the examined ions were 259.25 and 241.10. The retention time for 19-NA was 16.33 min and the examined ions were 259.15 and 277.15. The retention time for turinabol (I.STD) was 15.73 min and the examined ions were 317.73 and 335.25.
In hair samples, LOD of the method regarding the parent compound was 1.2 pg/mg, while for the two major metabolites 19-NE and 19-NA it was 2.8 pg/mg and 6.2pg/mg respectively. The LOQ for the parent compound was 4.0 pg/mg, while for the two major metabolites 19-NE and 19-NA were 9.3 pg/mg and 20.8 pg/mg, re-spectively. In hair samples, the average recovery of nandrolone was 92% and 119% for the metabolites. The accuracy of the method for nandrolone was 99%, while for 19-NE was 98% and 19-NA 102%. The % RSD in the hair samples was 14% for nandrolone, 29% for 19-NE and 17% for the 19-NA The linearity of the method was satisfactory for both the parent compound as well as for its metabolites (΄&γτ 0.99) in the concentration range studied (0-1000 pg/mg). In hair samples, only the parent com-pound was detected where the average concentration of the high dose group was 33,9 ± 5,9 pg/mg and the average concentration for the low dose group was 26,7 ± 1,0 pg/mg.
In the urine samples, LOD of the method regarding the parent substance was 0.9 ng/ml, while the two major metabolites, 19-NE and 19-NA were 1.8 ng/ml and 1.7 ng/ml respectively. The LOQ for the parent substance was 3.1 ng/ml, while the two major metabolites, 19-NE and 19-NA were 8.7 ng / ml and 5.5 ng /ml, respectively. The mean recovery for nandrolone was 75%, for 19-NE 101% and for 19-NA 114%. The accuracy of the method in urine samples for nandrolone was 104% and for 19-NE 93% and for 19-NA 98%. The % RSD was 27% for nandrolone, 25% for the 19-NE and 30% for 19-NA. The linearity of the method was satisfactory for both the par-ent substance as also for the metabolites (΄&γγγγτ 0.99) in the concentration range studied (0-1000 ng/ml). Urine samples of the exposed animals were found to be positive only to nandrolone metabolites with the high dose group having a mean concentration of 6.9 ± 4.0 ng/ml for 19-NE and respectively, the average concentration of 19-NA was 8.9 ± 4.5 ng/ml.
In the histological evaluation of the cardiac tissues, focal fibrosis and mild chronic inflammation in the high dose groups (HDIM, HDSC) was observed although mild focal fibrosis was also observed in the low dose group (LDIM). In addition to this, the HDSC group also had a noticeable edema. No statistically significant changes were observed in both the weight of the heart and the total weight of the animal body in which the anabolic substance was administered (p΄&γτ 0,05).
Animals that were exposed to the anabolic substance had a tendency for non-significant increased values of the myocardial mass (p=0.340), which was associated with the deterioration of the indices of total myocardial performance (MPI-PW: treated animals 0.73 ± 0.16 vs control group 0.52 ± 0.07, p = 0.026; MPI-TDI: treated ani-mals 0.91 ± 0.09 vs control group 0.63 ± 0.02, p = 0.001). The systolic function showed no change or trend for deterioration in the exposed animals. Moreover, ani-mals that received a high dose of anabolic substance showed a more pronounced increase in myocardial mass (myocardial mass-mmode: high-dose treated animals 6.0 ± 1.4 g vs low-dose treated animals 4.9 ± 0.31 g, p = 0.343) as well as more sig-nificant deterioration in the indices of total myocardial function compared with the low-dose group.
Measurement of oxidative stress markers (TBARS, carbonyls, TAC, catalase) showed a significant increase in the levels of TBARS (p ΄&λτ0,05) in the two high dose groups (HDIM, HDSC) and non-substantially reduction of catalase levels (p = 0,237, p = 0,238 respectively). Of particular interest is the fact that during the detoxification period, levels of TBARS and catalase returned to normal in the HDIM group but for the HDSC group, although the levels of catalase did return to normal, the level of TBARS increased (p = 0.01). In the low dose group (LDIM) levels of oxidative stress indicators remained practically constant. The levels of carbonyls and TAC did not show any significant differences in any treatment group.
Measurement of telomerase activity in heart tissues during the exposure peri-od significantly increased in all administration groups (LDIM 230% vs HDIM 552%, p = 0,004; and HDSC 212%). The intramuscular administration route may have con-tributed to the increased inflammation, as shown by the relative activity of telomerase in peripheral blood monocytes (HDIM 652% vs HDSC 312%, p = 0,003; LDIM 330% vs HDSC 312%, p = 0,20). During the detoxification period, all telomerase activity levels remained stable in the two high dose groups (p ΄&λτ0,05).
Measured levels of biochemical markers that are linked with cardiovascular function showed an inconsistent significant (p΄&γτ 0.05) increase in CPK levels in all administration groups (control: 332 ± 253 U / L, LDIM: 645 ± 442 U / L, HDIM: 1149 ± 733 U / L, HDSC: 461 ± 314 U / L) while a mild increase in LDH levels in the intra-muscular administration group was also noticed. A significant increase was observed for Troponin I levels in the HDSC group (p = 0,024) during the administration period. Elevated Troponin I levels were observed during the detoxification period for the aforementioned group as well as a sudden increase was observed in the BNP levels (7.3 ± 3.6 pg / mg).
Additionally, the measured levels of urea and creatinine in the serum showed an increase in all groups, with significant differences (p ΄&λτ0.05) only in the HD (urea: control: 13.8 ± 6.4 ng / dl, LDIM: 20.0 ± 5.7 ng / dl, HDIM: 21.6 ± 9.1 ng/dl, HDSC: 16.7 ± 7.3 ng / dl, creatinine: control: 0.37 ± 0.37 mg / dl, LDIM: 0.46 ± 0.27 mg / dl , HDIM: 0.55 ± 0.27 mg / dl, HDSC: 0.36 ± 0.26 mg / dl). Values of creatinine for the HDIM group decreased during the detoxification period by 20%, while values of urea significantly increased in the HDIM and HDSC groups (56%, p = 0,034 and 21%, p = 0,047, respectively) and non-significant changes occurred during the detoxification period.
There was also a change of oxidative stress indicators (TBARS, GSH) in kid-ney tissue in the HDIM and HDSC groups (control: TBARS: 17.7 ± 4.6 nmol / mg pro-tein, HDIM: 35.4 ± 7.2 nmol / mg protein, HDSC: 42 ± 29 nmol / mg protein, GSH: control: 0.138 ± 0.004 mol / mg protein, HDIM: 0.063 ± 0.020 mol / mg protein, HDSC: 0.098 ± 0.012 mol / mg protein). The levels of GSH decreased significantly (p = 0.018) by 50% in the HDIM group and by 29% in HDSC group (p = 0,046). During the period of detoxification, levels of oxidative stress markers practically remained unchanged with a non-significant (p΄&γτ 0,05) increased levels of TBARs and carbonyls in the HDSC group.
Measurements of telomerase activity in the renal tissues showed a significant increase only in the HDIM group (p = 0,020) throughout the administration period. During the detoxification period, relative telomerase activity decreased non-significantly in HDIM and HDSC groups (12% and 26%, respectively).
From the above results it appears that nandrolone is responsible for the dete-rioration in biochemical markers of renal function along with alterations in the kid-neys, presumably as a result of increased oxidative stress.
This protocol is an innovative research effort to study the side effects of the abuse of anabolic steroids as it examines diverse and innovative parameters so as to make an assessment of the extent and mechanism of nandrolone cardiotoxicity. In conclusion, prolonged use of nandrolone affects diastolic function, as shown by the indicators of total myocardial function. The increased levels of Troponin and BNP are an important indications of initial heart failure. The fact that there is an increase of Troponin during the detoxification period is a concerning sign for prolonged or de-layed toxic effects of the anabolic to the heart. In addition, histopathological findings demonstrate the local damage of heart tissue as well as that the increased activity of telomerase probably functions as a counteract mechanism due to the increase of ox-idative stress. Concluding, high dose groups are by far affected more compared to the low dose groups. The intramuscular administration of high doses seems to affect the cardiovascular system in relation to the corresponding low dose intramuscular administration. However, subcutaneous administration appears to cause the most invariant effects on the cardiovascular system.
(EN)
