Η μεταγραφή των γονιδίων τάξης ΙΙ του κυρίου συμττλόκου ιστοσυμβατότητας (MHCII) ρυθμίζεται από διάφορες πρωτεΐνες οι οποίες, δρώντας, συνεργειακά συγκροτούν το ενισχυόσωμα των τάξης ΙΙ. Αν και απαραίτητο, το ενισχυόσωμα από μόνο του δεν είναι αρκετό για τη μεταγραφική ενεργοποίηση αλλά απαιτεί την παρουσία μιας ακόμη πρωτεΐνης, του CIITA (Class II transactivator - Συνενεργοποιητής των τάξης ΙΙ), η οποία αποτελεί τον κύριο ρυθμιστή της μεταγραφικής ενεργότητας των γονιδίων αυτών. Παρόλα αυτά, η χρήση χημικών αναστολέων των απακετυλασών των ιστονών όπως η τριχοστατίνη Α (trichostatin A - TSA) μπορεί να οδηγήσει στην έκφραση των γονιδίων απουσία του CIITA, απαιτώντας μόνο την παρουσία του ενισχυοσώματος. Μελετήθηκε λεπτομερώς ο μηχανισμός της επαγωγής των γονιδίων αυτών, εστιάζοντας στις επιγενετικές τροποποιήσεις των ιστονών που ανιχνεύονται στην περιοχή του υποκινητή του γονιδίου DRA, ενός πρότυπου γονιδίου MHCII, σε διάφορους χρόνους έπειτα από αναστολή της απακετυλίωσης. Τα επίπεδα ακετυλίωσης των ιστονών Η3 και Η4 καθώς επίσης και διμεθυλίωσης της λυσίνης Κ4 της Η3 ανέβαιναν κατά την επώαση με TSA ενώ η διμεθυλίωση της λυσίνης Κ9 της Η3 μειώνονταν. Μελέτη της κινητικής του διαλυτού πυρηνικού κλάσματος των πρωτεϊνών HDAC1 και 2 και του συστατικού του ενισχυοσώματος RFX5, έδειξε ότι με TSA αυξάνεται η κινητικότητα των HDACs ενώ μειώνεται του RFX5. Τα δεδομένα αυτά έρχονται σε απόλυτη συμφωνία με άλλα από πειράματα ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης που δείχνουν αποσταθεροποίηση των απακετυλασών από τον υποκινητή του DRA και σταθεροποίηση του ενισχυοσώματος. Για να αποκτήσουμε μια πιο γενική άποψη των επιπτώσεων της αναστολής της απακετυλίωσης στη μεταγραφή των Β λεμφοκυττάρων, χρησιμοποιήθηκαν μικροσυστοιχίες ολιγονουκλεοτιδίων. Παρατηρήθηκε ότι ολόκληρη η οικογένεια των MHCII γονιδίων μαζί με αυτή των ιστονών καθώς επίσης και άλλα γονίδια στην περιοχή 6p21-22 επάγονται από TSA.
Ομαδοποίηση κατά λειτουργία των γονιδίων που επάγονται από TSA στα Β λεμφοκύτταρα έδειξε ότι πολλά από αυτά παίρνουν μέρος στην ανοσολογική απόκριση. Μελετήθηκε ο μηχανισμός της επαγωγής σε μεταγραφικό επίπεδο του STAT1, κύριου ρυθμιστή των γονιδίων αυτών, και βρέθηκε να ρυθμίζεται από το μεταλλαγμένο στα συγκεκριμένα κύτταρα ογκογονίδιο c-Myc. Ωστόσο, η ταυτόχρονη ενεργοποίηση με φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης STAT1 έπειτα από TSA οδήγησε στη μελέτη της παραγωγής ιντερφερόνης. Αφού αποδείχθηκε η παραγωγή της κυτοκίνης και ταυτοποιήθηκε αυτή ως τύπου Ι, βρέθηκε ότι επάγεται ολόκληρο το αντι-ιικό πρόγραμμα του κυττάρου. Υπεύθυνος για αυτόν τον καταρράκτη φωσφορυλιώσεων είναι ο ιός Epstein Barr virus (EBV) που βρίσκεται στον πυρήνα των κυττάρων που χρησιμοποιήθηκαν και μεταβάλλει την έκφραση των γονιδίων του έπειτα από TSA, επηρεάζοντας την ανοσολογική απόκριση του κυττάρου.
Στη συνέχεια εξετάστηκε εάν η επαγώμενη από ιντερφερόνη γ (IFNY) γονιδιακή έκφραση παρουσιάζει φαινόμενα μνήμης που ευαισθητοποιούν και επηρεάζουν τη γονιδιακή έκφραση σε επακόλουθο δεύτερο ερέθισμα. Βρέθηκε ότι τα γονίδια του MHCII διαθέτουν τέτοιους μηχανισμούς ώστε να απαντούν ταχύτερα και ισχυρότερα σε δεύτερο κύκλο επαγωγής αρκετές γενιές μετά το πρώτο ερέθισμα. Το γονίδιο DRA βρέθηκε να μετακινείται κοντά σε σωματίδια PML (PML nuclear bodies ή PML-NBs) κατά τη διάρκεια της μεταγραφικής ενεργοποίησης έπειτα από σηματοδότηση της IFNY. Η τοπολογία αυτή διατηρείται και μετά τη λήξη της μεταγραφής στις θυγατρικές γενεές. Η ταυτόχρονη αλληλεπίδραση της PML πρωτεΐνης με τη μεθυλοτρανσφεράση MLL έχει ως αποτέλεσμα την αναδιοργάνωση της χρωματίνης στην περιοχή του υποκινητή του DRA. Η αναδιοργάνωση αυτή χαρακτηρίζεται από χαλαρότερη νουκλεοσωμική δομή και υψηλότερα επίπεδα διμεθυλίωσης στη λυσίνη Κ4 της ιστόνης Η3 εξαιτίας της μεθυλοτρανσφεράσης, που επιτρέπουν την ταχύτερη στρατολόγηση του CIITA και κατά συνέπεια ταχύτερη απόκριση του γονιδίου σε δεύτερη φάση μεταγραφικής ενεργοποίησης. Συνεπώς κατά την πρώτη φάση της γονιδιακής έκφρασης πραγματοποιούνται αλλαγές στην οργάνωση του πυρήνα που φέρνουν το γονίδιο κοντά στα κατάλληλα υποπυρηνικά σωματίδια με αποτέλεσμα την μεταβολή στη σύσταση των επιγενετικών τροποποιήσεων των ιστονών του υποκινητή. Οι αλλαγές αυτές προσδίδουν τα χαρακτηριστικά της μνήμης στη γονιδιακή έκφραση και κατ' επέκταση στη λειτουργία του ανοσοποιητικού συστήματος.
(EL)
Transcription of the Class II genes of the Major Histocompatibility Complex (MHCII) requires a complex of proteins that synergistically bind to the promoter and constitute the MHCII enhanceosome. Although necessary, these proteins are not sufficient to drive transcription. The master coactivator CIITA is required for efficient transcriptional initiation and elongation. The deacetylase inhibitor Trichostatin A (TSA) induces the transcription of the MHCII DRA gene in a CIITA-independent manner. To analyze the molecular mechanisms by which this epigenetic regulator stimulates MHCII expression, chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays were employed to monitor the alterations in histone modifications that correlate with DRA transcription after TSA treatment. A dramatic increase in promoter linked histone acetylation and Histone H3 lysine 4 methylation followed by concurrent decrease of lysine 9 methylation were found. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments showed that TSA treatment increased the mobility of HDAC while decreasing the mobility of the class II enhanceosome factor RFX5. These data, in combination with ChIP experiments, indicate that the TSA-mediated induction of DRA transcription involves HDAC relocation and enhanceosome stabilization. In order to gain a genome-wide view of the genes responding to inhibition of deacetylases, we compared the transcriptome of B cells before and after TSA treatment using Affymetrix microarrays. This analysis showed that in addition to the DRA gene, the entire MHCII family and the adjacent histone cluster, located in chromosome 6p21-22, are strongly induced by TSA.
A complex pattern of gene reprogramming by TSA involves immune recognition, antiviral, apoptotic and inflammatory pathways and extends the rationale for using Histone Deacetylase Inhibitors (HDACi) to modulate the immune response. Since many of these genes are direct targets of STAT1 transcription factor we monitored its expression after TSA treatment and found it to be induced. This induction was mediated by the simultaneous down-regulation of c-Myc oncogene expression thus revealing a negative feedback loop between the two genes. Concurrent activation by tyrosine phosphorylation of the produced STAT1 protein prompted for the examination of interferon (IFN) production. Its presence in the culture supernatant was confirmed and was identified as type I IFN. The whole antiviral response of the cell was found to be activated by TSA. The presence of Epstein Barr virus (EBV) was crucial for the initiation of this response.
Adaptation is one essential property of the immune response conferred by immunological memory. The question whether IFN-gamma (IFNβ) inducible transcription generates memory that sensitizes cells to a secondary stimulus was addressed. The MHCII gene DRA was found to relocate to Promyelocytic leukemia nuclear bodies (PML-NB) upon induction with IFNβ and this topology was maintained long after transcription shut off.
Concurrent interaction of PML protein with Mixed Lineage Leukemia (MLL) generates a prolonged permissive chromatin state on the DRA gene characterized by high promoter histone H3 K4 dimethylation that facilitates rapid expression upon restimulation. Primary signal-induced transcription generates spatial and epigenetic memory that is maintained through several cell generations and endows the immune system with increased responsiveness to future activation signals.
(EN)
