Η πνευμονική αρτηριακή υπέρταση είναι νόσος η οποία χαρακτηρίζεται από αυξημένη πνευμονική αρτηριακή πίεση, αγγειοσυστολή, αναδιαμόρφωση και πάχυνση του αγγειακού τοιχώματος με τελικό αποτέλεσμα την υπερτροφία και ανεπάρκεια της δεξιάς κοιλίας.
Η φλεγμονή του πνευμονικού παρεγχύματος εμπλέκεται στην ανάπτυξη και διατήρηση της αναδιαμόρφωσης των πνευμονικών αγγείων και ένας μεγάλος αριθμός μελετών υποστηρίζει ότι αποτελεί πιθανή αιτία ανάπτυξης πνευμονικής υπέρτασης. Προ-φλεγμονώδεις κυτοκίνες και κυτταροκίνες, όπως είναι ο CCL2 και ο CCL12 (παλαιότερα γνωστοί και ως χημειοτακτικοί παράγοντες των μονοκυττάρων; ΜCP-1, MCP-5), εμπλέκονται άμεσα στην ανάπτυξη πνευμονικής υπέρτασης. Τα επίπεδα αυτών των κυτοκινών βρέθηκαν να σχετίζονται με την επιβίωση ασθενών. Η μελέτη αυτής της νόσου γίνεται συχνά με μοντέλα ζώων τα οποία εκτίθενται σε υποξία. Έκθεση των ποντικιών σε χρόνιες συνθήκες υποξίας (8.5% Ο2 για 21 ημέρες) έχει ως αποτέλεσμα την αγγειοσυστολή και πάχυνση του αγγειακού τοιχώματος (αύξηση έκφρασης ακτίνης λείου μυικού ιστού στα κύτταρα) και αναπαριστά την αύξηση της συστολικής πίεσης της δεξιά κοιλίας και την παθολογία της ανθρώπινης νόσου.
Οι οξυγενάσες της αίμης (heme oxygenases, HO) είναι ένζυμα τα οποία καταλύουν τη μετατροπή της αίμης σε χολερυθρίνη, μονοξείδιο του άνθρακα (CO) και σίδηρο και εμπλέκονται συχνά στη ρύθμιση της φλεγμονώδους απάντησης του οργανισμού. Πρόσφατα αποτελέσματα από το εργαστήριο μας έχουν δείξει πως η συνεχής τοπική έκφραση της οξυγενάσης της αίμης – 1 (HO-1) στον πνεύμονα μπορεί να καταστείλει τόσο την πνευμονική φλεγμονή όσο και τη μετέπειτα εμφάνιση της πνευμονικής υπέρτασης. Επιπλέον η επαγόμενη τοπική έκφραση στον πνεύμονα της HO-1 έχει βρεθεί να προκαλεί μετατροπή στο φαινότυπο των κυψελιδικών μακροφάγων των υποξικών ποντικών, σε προ-φλεγμονώδη τύπο, ο οποίος προστατεύει από την μετέπειτα εμφάνιση πνευμονικής υπέρτασης. Θεραπεία HO -/- ποντικών με ένα από τα προϊόντα της HO-1 το μονοξειδίου του άνθρακα (CO), κατέστειλε την αναδιαμόρφωση και πάχυνση του αγγειακού τοιχώματος αυτών των ποντικών.
Τα μικρομοριακά RNA (microRNAs) ανήκουν σε μια κατηγορία μετά-μεταγραφικών ρυθμιστικών παραγόντων. Ανακαλύφθηκαν για πρώτη φορά το 1993
MiRNAs and Pulmonary Hypertension Konstantinou K. Georgios
5
από τους Victor Ambros, Rosalind Lee και Rhonda Feinbaum κατά τη διάρκεια μιας μελέτης για την ανάπτυξη στο νηματώδη C.elegans. Πρόκειται για σύντομες ~ 22 νουκλεοτιδικές αλληλουχίες RNA που συνδέονται με συμπληρωματικές ακολουθίες στο UTR 3' των πολλαπλών mRNAs στόχων τους. Με τη σύνδεση τους στα mRNA των πρωτεϊνών-στόχων επάγουν την αποδόμηση τους με αποτέλεσμα την καταστολή της σύνθεσης της συγκεκριμένης πρωτεΐνης. Τα microRNAs εμπλέκονται στην ανάπτυξη και πολλαπλασιασμό των κυττάρων, στην διαφοροποίηση, στην απόπτωση, στη ρύθμιση του ανοσοποιητικού συστήματος ακόμη και στον καρκίνο. Μέχρι σήμερα έχουν χαρακτηριστεί περισσότερα από 90 επαγόμενα από την υποξία microRNAs.
Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε ένα διαγονιδιακό μοντέλο ποντικού το οποίο δημιουργήθηκε από τη διασταύρωση ποντικών, που εκφράζουν τον ενεργοποιητή της μεταγραφής της τετρακυκλίνης υπό τον έλεγχο του υποκινητή των επιθηλιακών κυττάρων Clara cells του πνεύμονα με ποντικούς που φέρουν το ανθρώπινο διαγονίδιο της HO-1 υπό την έκφραση του υποκινητή του βακτηριακού οπερονίου της τετρακυκλίνης (ΤRE), και έτσι υπερεκφράζει HO-1 με επαγόμενο ιστοειδικό τρόπο (tetΟΝ σύστημα). Ελέγχοντας έτσι την δράση της ΗΟ-1 και κατ’ επέκταση της πνευμονικής φλεγμονής, στόχος μας ήταν να διασαφηνίσουμε την φύση της φλεγμονώδους ανοσοαπάντησης στην υποξία και τον ρόλο της στην ανάπτυξη της πνευμονικής υπέρτασης. Διαγονιδιακά ποντίκια με συνεχή έκφραση της HO-1 (SHO1) έχουν επίσης χρησιμοποιηθεί.
Η συστολική πίεση στη δεξιά κοιλία και ο δείκτης Fulton είχαν αυξηθεί σημαντικά στα διαγονιακά μας ποντίκια μετά από 21 ημέρες έκθεση σε υποξία. Η χορήγηση τετρακυκλίνης καθ’ όλη την διάρκεια της έκθεσης σε υποξία απέτρεψε την αύξηση της συστολική πίεσης στη δεξιά κοιλία και του δείκτη Fulton στα ποντίκια αυτά σε σύγκριση με τα ποντίκια στα οποία χορηγήθηκε μόνο νερό.
Στη μελέτη μας έχουμε βρει ότι οι μεταγραφικοί παράγοντες fork-head box S1 (Foxs1) και SRY box 17 (Sox17), οι οποίοι σχετίζονται με τη διαφοροποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων και την αναδιαμόρφωση του αγγειακού τοιχώματος, αυξάνονται κατά την έκθεση των ποντικών σε υποξία. Ακόμη, σημαντική ήταν και η αύξηση ενός νέου γονιδίου στόχος του Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1), Ankyrin repeat domain 37 (Ankrd37). Επιπλέον, ο Hypoxia-induced mitogenic factor (HIMF/FIZZ1), τυπικός δείκτης της εναλλακτικής οδού ενεργοποίησης των
MiRNAs and Pulmonary Hypertension Konstantinou K. Georgios
6
μακροφάγων (Μ2) είχε μειωθεί από την HO-1 τόσο στον πνεύμονα όσο και στα κυψελιδικά μακροφάγα των υποξικών ποντικών. Τέλος οι παράγοντες CCL2 και ο CCL12, μη κανονικοί επαγωγείς του Μ2 φαινοτύπου βρέθηκαν να επηρεάζονται από την χορήγηση μονοξειδίου του άνθρακα (CO).
Ο πιθανόν ρόλος του miR-155 στη μετατροπή του φαινοτύπου στα μακροφάγα έχει επίσης διερευνηθεί. Συγκεκριμένα η χορήγηση CO αύξησε την έκφραση του miR-155 στον πνεύμονα, το οποίο έχει ήδη αποδειχθεί πως σχετίζεται με τα επίπεδα του υποδοχέα της ιντερλευκίνης-13 (IL-13) και ως εκ τούτου με τον M2 φαινότυπο στα μακροφάγα. Περαιτέρω, για να κατανοήσουμε το μοτίβο έκφρασης των microRNAs τα οποία επάγονται από την HO-1 κατά την διάρκεια των πρώτων σταδίων ανάπτυξης πνευμονικής υπέρτασης, έχουμε κάνει ένα miRNA array.
Η κατανόηση των κυτταρικών και μοριακών μηχανισμών οι οποίοι ευθύνονται για την ανάπτυξη της πνευμονικής υπέρτασης θα βοηθήσει στην ανάπτυξη στοχευμένων φαρμάκων τα οποία θα συμβάλουν στην θεραπεία της νόσου.
(EL)
Pulmonary hypertension (PH) is a disease characterized by elevated pulmonary artery pressure, vasoconstriction, cell proliferation and vascular wall remodeling with resultant right ventricular hypertrophy and failure.
Lung inflammation has an important role in the initiation and maintenance of vascular remodeling and an increasing number of studies support the idea that this remodeling is a potential cause for the development of pulmonary hypertension. Pro-inflammatory cytokines and chemokines are involved in the pathogenesis of PH, such as CCL2 and CCL12. The levels of these cytokines are thought to be related to patients’ survival. PH is most commonly studied using the hypoxic animal model. Long-term exposure of mice to hypoxia leads to muscularization of small pulmonary arteries - increased expression of smooth muscle actin in cells - and recapitulates the elevation of right ventricular systolic pressure and the pathology of human disease.
Heme oxygenases (HO) are the rate-limiting enzymes that catalyze the conversion of heme into biliverdin, carbon monoxide (CO), and free iron. An increasing number of studies implicate HO-1 in the regulation of inflammation. Results from our lab indicate that lung-specific constitutive expression of HO-1 can suppress both the lung inflammation and the later development of pulmonary hypertension. Furthermore, overexpression in a lung-specific way of HO-1 was found to induce a switch in macrophage polarity toward an anti-inflammatory phenotype, and this effect was associated with protection from PH. Interestingly treatment of HO-1-/- mice with inhaled CO also protected them from pulmonary vascular remodeling.
MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding transcripts of 16 to 29 nucleotide RNAs that regulate gene expression posttranscriptionally by targeting mRNAs. MicroRNAs have been shown to play important biological roles in various contexts; during development, cell differentiation, and immune regulation and also in pathologies such as cancer. To date more than 90 hypoxia-regulated miRNAs (HRMs) have been discovered.
In the present study, we utilized a bitransgenic mouse model, that was generated by crossing of mice that express the reverse tetracycline transactivator (rtTA) under the control of Clara cell secretory protein promoter (CC10) with mice
MiRNAs and Pulmonary Hypertension Konstantinou K. Georgios
8
that harbor the human HO-1 transgene under the control of the bacterial tetracycline response element (TRE) and expressed HO-1 in a lung-specific, inducible way (tetOn system). By turning on and off HO-1 activity and modulating lung inflammatory response, our goal was to shed light on the nature of this hypoxia-induced inflammatory response and its role in the later development of the disease. Transgenic (SH01) mice for the HO-1 gene were also used.
Right ventricular systolic pressure, the Fulton Index, and the medial wall thickness index, were significantly elevated after 21 days of hypoxia in our bitransgenic mice. Doxycycline administration for the entire course of hypoxia prevented the increase in right ventricular systolic pressure, the Fulton Index, and the medial wall thickness index in a comparison with the water treaded control mice.
It has been shown in our study that hypoxia leads to induction of the fork-head box S1 (Foxs1) and the SRY box 17 (Sox17) transcription factors, which are found to be involved in the regulation of endothelial cell differentiation and vessel remodeling. Furthermore a striking increase of the Ankyrin repeat domain 37 (Ankrd37) a novel Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) target gene was also observed. Hypoxia-induced mitogenic factor (HIMF/FIZZ1), a well-defined marker of alternative activated macrophages (M2) was altered by HO-1 expression both in the total lung and in the alveolar macrophages. Finally, the chemokine (C-C motif) ligand 2 (CCL2) and the chemokine (C-C motif) ligand 12 (CCL12) noncanonical inducers of M2 polarization were found to be suppressed by CO administration.
A potential role of miR-155 in the polarization of macrophages was demonstrated. Specifically CO induced the expression of miR-155 in total lung, which has been reported to target and decrease IL-13 receptor levels and subsequently the expression of the M2 phenotype. Moreover in order to identify the expression pattern of miRNAs induced by HO-1 during the first stages of pulmonary hypertension a miRNA array was performed.
Further understanding of the cellular and molecular pathways that contribute to the progression of pulmonary hypertension is needed, in order to lead to the development of targeted therapies, which may raise hope for the cure.
(EN)
