Ο ρόλος της αυτοφαγίας στο σχηματισμό του αυτοδραστικού φαινοτύπου των μονοκυττάρων από ασθενείς με Συστηματικό Ερυθυματώδη Λύκο (ΣΕΛ) μέσω της σηματοδότησης από ιντερφερόνη-α

 
This item is provided by the institution :
University of Crete
Repository :
E-Locus Institutional Repository
see the original item page
in the repository's web site and access all digital files if the item*
share




2014 (EN)
Delineating the role of autophagy in shaping the autoreactive phenotype of monocytes from patients with Systemic Lupus Erythematosus (SLE) upon IFNa signaling
Ο ρόλος της αυτοφαγίας στο σχηματισμό του αυτοδραστικού φαινοτύπου των μονοκυττάρων από ασθενείς με Συστηματικό Ερυθυματώδη Λύκο (ΣΕΛ) μέσω της σηματοδότησης από ιντερφερόνη-α

Καμπράνη, Ελένη Γ.

Γκιρτζιμανάκη, Κατερίνα
Βεργίνης, Παναγιώτης
Θεοδωρόπουλος, Παναγιώτης
Σπηλιανάκης, Χαράλαμπος
Τοκατλίδης, Κωνσταντίνος

Ο συστηματικός ερυθηματώδης λύκος (ΣΕΛ) είναι μια χρόνια, συστηματική αυτοάνοση διαταραχή, που κατά κύριο λόγο προσβάλει γυναίκες, στην οποία η ανοσολογική ανοχή σε αυτόλογα νουκλεϊκά οξέα και πρωτεΐνες χάνεται, με αποτέλεσμα την εμμένουσα φλεγμονή και την παραγωγή αυτοαντισωμάτων που προκαλούν ιστική βλάβη. Ο παθογενετικός ρόλος των ιντερφερονών τύπου Ι στον ΣΕΛ υποστηρίζεται από την ύπαρξη μιας “γονιδιακής υπογραφής”, ενός συνόλου γονιδίων η έκφραση των οποίων ρυθμίζεται υπό την επίδραση ιντερφερονών, στα λευκοκύτταρα του περιφερικού αίματος των ασθενών με ΣΕΛ. Επίσης, τα υψηλά επίπεδα ιντερφερόνης-α στον ορό ασθενών όπου ανιχνεύονται συμβαδίζουν με την ενεργότητα αλλά και την σοβαρότητα της νόσου. Τα αυτοδραστικά μονοκύτταρα στον ΣΕΛ χαρακτηρίζονται από τον εξαρτώμενο από ιντερφερόνη-α φαινότυπό τους και η διαφοροποίησή τους αλλά και η παρουσίαση των αυτοαντιγόνων από τις πρωτεΐνες του μείζονος σύμπλοκου ιστοσυμβατότητας τύπου ΙΙ έχει δειχθεί ότι εξαρτάται από την κυτταρική αυτοφαγία. Η αυτοφαγία είναι μια καταβολική διαδικασία του κυττάρου που περιλαμβάνει την αποικοδόμηση των περιττών και μη-λειτουργικών συστατικών του και βασίζεται στη συνεργασία των αυτοφαγοσωμάτων με τα λυσοσώματα. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η διαλεύκανση του ρόλου της αυτοφαγίας στο σχηματισμό του αυτοδραστικού φαινοτύπου των μονοκυττάρων από ασθενείς με ΣΕΛ μέσω της σηματοδότησης της ιντερφερόνης-α. Γι’ αυτό το σκοπό, CD14+ μονοκύτταρα απομονώθηκαν από ασθενείς με ΣΕΛ αλλά και από υγιείς εθελοντές αιμοδότες και τα επίπεδα των αυτοφαγικών πρωτεϊνών LC3 και P62 αναλύθηκαν μέσω ανοσοαποτύπωσης κατά western και συνεστιακής μικροσκοπίας. Τα επίπεδα των αγγελιοφόρων RNA για τα αυτοφαγικά γονίδια ATG5 και P62 αναλύθηκαν μέσω πραγματικού χρόνου αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης. Αντίστοιχα πειράματα πραγματοποιήθηκαν και με ex vivo χειρισμό μονοκυττάρων και επώασής τους με 10% v/v ορό από ασθενείς με ΣΕΛ και υγιείς αιμοδότες αλλά και με χορήγηση ανασυνδυασμένης ιντερφερόνης-α σε συγκέντρωση 104U/ml. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα μονοκύτταρα ασθενών με ΣΕΛ παρουσιάζουν αυξημένα επίπεδα αυτοφαγίας σε σχέση με τα υγιή δείγματα. Επίσης, η επώαση υγιών μονοκυττάρων με ορό από ασθενείς με ΣΕΛ ή με ανασυνδυασμένη ιντερφερόνη-α προκάλεσε την αύξηση της αυτοφαγίας. Η αντιγονοπαρουσιαστική ικανότητα των υγιών μονοκυττάρων μετά τη χορήγηση της ιντερφερόνης-α ήταν επίσης αυξημένη με βάση την έκφραση των μεμβρανικών δεικτών HLA-DR και CD-86 σε πειράματα κυτταρομετρίας ροής. Τέλος, πραγματοποιώντας πειράματα συνεστιακής μικροσκοπίας μονοκυττάρων από ασθενείς με ΣΕΛ σε σύγκριση με υγιή δείγματα αλλά και υγιών μονοκυττάρων στα οποία χορηγήθηκε ιντερφερόνη-α για διαφορετική χρονική διάρκεια, κατέδειξαν ότι η ολοκλήρωση της αυτοφαγίας είναι διαταραγμένη στο περιβάλλον της νόσου. Η μη ολοκληρωμένη καταστροφή του περιεχομένου των αυτοφαγολυσσωσομάτων αποτελεί πηγή αυτοαντιγόνων, τα οποία δεσμεύονται από το σύμπλοκο ιστοσυμβατότητας τύπου ΙΙ και μπορούν να προκαλέσουν αυτοάνοση ανοσολογική απάντηση. Είναι μείζονος σημασίας να διαλευκανθεί ένας πιθανός μηχανισμός μέσω του οποίου η ιντερφερόνη-α μπορεί να προκαλέσει απορρύθμιση της αυτοφαγίας και να οδηγήσει συνεπώς στην παραγωγή αυτοαντισωμάτων, όχι μόνο στην περίπτωση του ΣΕΛ αλλά και σε άλλα αυτοάνοσα νοσήματα. Αποκτώντας αυτή τη γνώση, πιο στοχευμένη θεραπεία μπορεί να αναπτυχθεί σε αυτές τις χρόνιες ασθένειες. (EL)
Systemic lupus erythematosus (SLE) is a chronic autoimmune disorder, predominantly affecting females, in which loss of tolerance to nucleic acids and their interacting proteins results in the production of pathogenic autoantibodies that cause inflammation and tissue damage. The pathogenic role of type I IFNs in SLE is supported by a signature of IFN-induced genes in the peripheral blood of patients and from high IFN-a serum levels in active SLE patients, which is associated with high disease activity and severity. Autoreactive monocytes in SLE are characterized by IFNa-dendritic cell-like phenotype and their differentiation and capacity to present self-antigen by major histocompatibility class (MHC-) II proteins has been shown to depend on cell autophagy. Autophagy is a cellular catabolic process that involves degradation of unnecessary or dysfunctional cellular components and relies on the cooperation of autophagosomes with lysosomes. The aim of this project was to delineate the role of autophagy in shaping the autoreactive phenotype of SLE monocytes upon IFNa signaling. For this purpose, CD14+ monocytes were isolated both from SLE patients and healthy donors and the levels of the autophagic proteins LC3 and P62 were assessed by immunobloting analysis and confocal microscopy. ATG5 and P62 mRNA levels were assessed by Real Time PCR. The same experimental approach was followed in ex vivo treatments of CD14+ healthy monocytes with 10% v/v SLE or healthy serum and recombinant human IFNa 104U/ml. The results from these experiments indicated that SLE monocytes exhibit increased levels of autophagy and that treatment of healthy monocytes with SLE serum or recombinant IFNa can induce autophagy. The antigen presenting capacity of healthy monocytes treated with rIFNa was assessed by flow cytometry for the expression of HLA-DR and CD86 surface markers. The results showed that monocytes have increased antigen presenting capacity when treated with rIFNA. Finally, alterations in the autophagolysosomal pH were observed by conducting immunofluoresence analysis of SLE monocytes compared to healthy controls but also of healthy monocytes treated with rIFNa at different time-points. The acidic autophagolysosomal pH sensitive dye, Lysotracker Red-DND99, exhibited significantly reduced staining implying that the autophagic flux may be deregulated in the lupus milieu. As a consequence, not fully processed self-antigens inside autophagolysosomes could be loaded in the Major Histocompatibility Complex II (MHCII) and subsequently trigger an autoimmune response. It is of great importance to unravel a possible mechanism through which IFNa can result in deregulation of autophagy and the production of autoantibodies not only in the context of lupus but also in other autoimmune diseases. By acquiring this knowledge, more targeted therapeutic approaches could be established to these incurable diseases up until now. (EN)

text
Τύπος Εργασίας--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης

Ιντερφερόνη-α
Αυτοφαγία
Μονοκύτταρα

Πανεπιστήμιο Κρήτης (EL)
University of Crete (EN)

English

2014-11-21


Σχολή/Τμήμα--Σχολή Θετικών και Τεχνολογικών Επιστημών--Τμήμα Βιολογίας--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης



*Institutions are responsible for keeping their URLs functional (digital file, item page in repository site)