Frem3: ένα νέο μέλος της οικογένειας των γονιδίων Fras1/Frem. Εντοπισμός έκφρασης στον ποντικό και απομόνωση γενωμικών ενθεμάτων

 
This item is provided by the institution :
University of Crete
Repository :
E-Locus Institutional Repository
see the original item page
in the repository's web site and access all digital files if the item*
share




2005 (EN)
Frem3: ένα νέο μέλος της οικογένειας των γονιδίων Fras1/Frem. Εντοπισμός έκφρασης στον ποντικό και απομόνωση γενωμικών ενθεμάτων

Παυλάκης, Ευάγγελος

To βασικό έλασμα είναι ένας ευέλικτος λεπτός σχηματισμός εξωκυττάριας, ουσίας που βρίσκεται σε όλους σχεδόν τους πολυκύτταρους οργανισμούς, και η οποία διαμερισματοποιεί τους ιστούς, λειτουργεί ως εμπόδιο για την ανεξέλγκτη διέλευση μακρομορίων και παγιδεύει μια σειρά από σηματοδοτικά μόρια και αυξητικούς παράγοντες. Με ηλεκτρονική μικροσκοπια διέλευσης, διαχωρίζεται σε δύο διακριτές περιοχές, τη lamina lucida, τη lamina densa, καθώς και μια περιοχή που υπόκειται της τελευταίας, τη sub-lamina densa. Το γονίδιο Fras1 (Fraser syndrome protein 1), κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη του εξωκυττάριου χώρου, η οποία προέρχεται αποκλειστικά από εμβρυϊκά επιθήλια και εντοπίζεται στην περιοχή της sub-lamina densa. Μια από τις 5 bleb μεταλλαγές, η blebbed έχει αποδοθεί στο γονίδιο Fras1. Αντίστοιχα, 2 από τις 5 bleb μεταλλαγές έχουν αποδοθεί σε διαφορετικά γονίδια της οικογένειας Fras1/Frem πρωτεϊνών (τα Frem1 και Frem2), ενώ μια ακόμα μεταλλαγή αποδόθηκε στο γονίδιο Grip1, το οποίο κωδικοποιεί μια κυτταροπλασματική πρωτεΐνη πλούσια σε PDZ περιοχές. Η 5η μεταλλαγή δεν έχει χαρτογραφηθεί, ενδεχομένως όμως το γονίδιο Frem3 το οποίο παρουσιάζει σημαντική ομολογία με το Fras1, να είναι υπεύθυνο για την μεταλλαγή αυτή. Όλες οι bleb μεταλλαγές παρουσιάζουν τον ίδιο φαινότυπο, δηλαδή υποεπιδερμικές φουσκαλίδες, συνδακτυλίες και κρυπτοφθαλμία. Με στόχο την κατανόηση της μοριακής βάσης του συνδρόμου Fraser και των πιθανών αλληλεπιδράσεων μεταξύ των πρωτεϊνών της οικογένειας Fras1/Frem, στην παρούσα εργασία πραγματοποιήσαμε διερεύνηση φαγικών βιβλιοθηκών, με σκοπό την την απομόνωση τμημάτων των γενωμικών DNA των γονιδίων Frem2 και Frem3, καθώς και την απομόνωση του cDNA του γονιδίου Frem2. Το cDNA του γονιδίου Frem2 θα χρησιμοποιηθεί σε πειράματα πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων, ενώ το γενωμικό DNA του Frem3 γονιδίου θα χρησιμεύσει για την απενεργοποίησή του σε ποντίκια με ομόλογο ανασυνδυασμό. Στην εργασία αυτή καταφέραμε να απομονώσουμε 6 θετικούς κλώνους οι οποίοι φέρουν τμήμα του cDNA του γονιδίου Frem2 και προχωρούμε παραπέρα στον χαρακτηρισμό τους. Aκόμα, όσον αφορά την απομόνωση του γενωμικού τμήματος του γονιδίου Frem3, έχουμε απομονώσει μια σειρά από κλώνους οι οποίοι θα χρησιμοποιηθούν για την τελική σάρωση, ενώ αντίστοιχα και για το γενωμικό τμήμα του Frem2, απομονώσαμε 6 κλώνους οι οποίοι θα χρησιμοποιηθούν για τη δεύτερη σάρωση. Παράλληλα, και με σκοπό τον παραπέρα χαρακτηρισμό του γονιδίου Frem3, το οποίο δεν έχει μέχρι τώρα μελετηθεί, πραγματοποιήθηκαν μελέτες του προτύπου έκφρασής του, σε τομές εμβρύων ποντικού αγρίου τύπου, μέσα από τεχνικές ανοσοϊστοχημείας και RNA in situ υβριδοποίησης (ΙSH). Τα αποτελέσματα από την ISH, φανέρωσαν την επιθηλιακή προέλευση και αυτού του γονιδίου, όπως συμβαίνει και με τα υπόλοιπα γονίδια της οικογένειας. Eπιλπέον, με τα πειράματα ανοσοανίχνευσης η πρωτεΐνη εντοπίστηκε στις βασικές μεμβράνες διαφόρων ιστών, από ποικίλα αναπτυξιακά στάδια, ξεκινώντας από την Ε11.5 και φτάνοντας την Ε15.5 να παρουσιάζει το εντονότερο πρότυπο έκφρασης. Παρόλα αυτά, εντοπίστηκε και σε κάποιους ιστους να περιβάλλει τους πυρήνες των επιθηλιακών κυττάρων, όπως ακριβώς και η πρωτεΐνη Frem1, και αντίθετα με τις Fras1/Frem2, υποδυκνείοντας μια πιθανή συνεργασία των δυο πρωτεϊνών, αλλά και τον ενδεχόμενο ενδοκυτταρικό εντοπισμό της. (EL)
Basement membranes are thin, sheet like arrangements of extracellular matrix proteins that serve a variety of functions, including the physical separation of cell layers and tissues, molecular ultrafiltration and tissue morphogenesis and display two distinct zones, the lamina lucida and the electron dense lamina densa which lies underneath the lamina lucida. Fras1 is expressed by various epithelia during mouse development, whereas the encoded protein is localized within the sub-lamina densa of the epithelial basement membranes. Mutations in Fras1/FRAS1 are responsible for the blebbed phenotype in mouse and the Fraser syndrome in man, respectively. Τhree of the 5 ‘bleb’ mutations in mouse which exhibit similar phenotypes, have been ascribed to Fras1 or Fras1-related genes: Fras1 which has been linked to the blebbed phenotype, Frem1 responsible for the head-blebs, and Frem2 for the myelencephalic bleb mutation and only FRAS1 has been associated with Fraser syndrome. Also, the Grip1 gene, which encodes a cytoplasmic PDZ protein, has been linked to the eye-bleb mutant. The translation product of Frem3 exhibits significant homology to Fras1, and it could potentially be responsible for the fifth bleb mutation, however this has not yet been proved. All 5 bleb mutations are characterized by sub-epidermal hemorrhagic blisters, renal agenesis or dysplasia, fused eye lids and syndactyly. Aiming to understand the molecular basis of Fraser syndrome, as well as, the structural and functional defects underlying the phenotype and the relation, if any, of the Fras1/Frem family of proteins, in this project we performed phage library screenings in order to isolate part of the genomic DNA of Frem2 and Frem3, as well as the cDNA of Frem2. The cDNA of Frem2 gene will provide a useful tool in order to study protein-protein interactions, both between Fras1/Frem proteins and between proteins of this family with other proteins of the extracellular matrix. On the other hand, and since Frem3 has not yet been studied, the isolation of its genomic DNA will be used in order to inactivate it in mouse and study the outcome phenotype. Importantly, we isolated 6 putatively positive clones, which contain part of the cDNA of Frem2 and we now proceed further for their characterization. Ιn addition, we have also isolated a series of positive clones, for the isolation of Frem2 and Frem3 genomic DNA, which will be used for the second and third screening, respectively. Moreover, in order to characterize further the Frem3 gene we made antibodies against the protein, as well as RNA-probe, and studied its expression pattern in wild type mouse embryos, of various developmental stages, through immunohistochemical and RNA in situ hybridization (ISH) techniques. The results from ISH indicated the epithelial origin of Frem3, which is consistent with the pattern seen at the rest genes of the family. Also, immunohistochemistry showed expression of Frem3 protein at the basement membranes of various epithelia (e.g. epidermis, lungs, kidneys, gut), beginning at E11.5 and reaching the best expression pattern at E15.5. However, in the skin and choroids plexus, it was shown to surround the epithelial cell nucleus, resembling the expression pattern of Frem1 protein and indicating a possible cooperation between those proteins, as well as an intracellular localization, as opposed to Fras1 and Frem2. (EN)

text
Τύπος Εργασίας--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης

Πανεπιστήμιο Κρήτης (EL)
University of Crete (EN)

Greek

2005-11-28


Σχολή/Τμήμα--Σχολή Θετικών και Τεχνολογικών Επιστημών--Τμήμα Βιολογίας--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης



*Institutions are responsible for keeping their URLs functional (digital file, item page in repository site)