Στον τομέα της νανο-τεχνολογίας, το πεδίο των βιοϋλικών που βασίζονται σε πεπτίδια και πρωτεΐνες είναι ραγδαίως αναπτυσσόμενο. Η καλύτερη κατανόηση του μηχανισμού της αναδίπλωσης πρωτεϊνών προσφέρει σημαντικές πληροφορίες για την ανάπτυξη του πεδίου αυτού, καθώς ο ορθολογιστικός σχεδιασμός καινοτόμων βιοϋλικών αναπτύσσεται μέσω διερεύνησης των ιδιοτήτων αυτό-οργάνωσης κατάλληλων πρωτεϊνικών ικριωμάτων.
Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, διερευνήθηκε η δυνατότητα χρήσης του δομικού μοτίβου των 4-α-ελικοειδών δεματίων ως νέου δομικού λίθου για τη δημιουργία βιοϋλικών αφού πρώτα μελετήθηκε ο μηχανισμός αναδίπλωσής του. Ως μοντέλο χρησιμοποιήθηκε η μικρή ομοδιμερής πρωτεΐνη Rop που αποτελεί χαρακτηριστικό παράδειγμα αυτού του δομικού μοτίβου.
Στα πλαίσια της προσέγγισης τους προβλήματος της αναδίπλωσης των χρησιμοποιηθέντων 4-α-ελικοειδών δεματίων, έγιναν προσπάθειες διαλεύκανσης του ρόλου της στροφής και της πιθανής δημιουργίας ενδιάμεσων δομικών καταστάσεων της πρωτεΐνης Rop. Βάση του μεταλλάγματος A31P, στο οποίο η μετάλλαξη σε προλίνη του κεντρικού αμινοξέος (αλανίνη) της στροφής, στη θέση 31, οδήγησε σε δραματική αλλαγή τοπολογίας του δεματίου, σχεδιάστηκαν και μελετήθηκαν με δομικές και βιοφυσικές μεθόδους τρία νέα ματαλλάγματα της Rop με εισαγωγή καταλοίπων γλυκίνης και προλίνης στην περιοχή της στροφής. Επιβεβαιώθηκε ότι η στροφή παίζει πολύ σημαντικό ρόλο στην τελική διαμόρφωση του διμερούς Rop και είναι πολύ ευαίσθητη στην τοπική αμινοξική αλληλουχία.
Από το σύνολο των μελετών της αναδίπλωσης της πρωτεΐνης Rop προέκυψε μία πληθώρα μεταλλαγμένων δομών, φανερώνοντας μία ασυνήθιστη δομική ευπλασία. Στηριζόμενοι σε αυτή την ιδιότητα και βάσει του RM6, Rop μεταλλάγματος, που αναδιπλώνεται σχηματίζοντας ένα επίμηκες σταθερό, ομοτετραμερές α-ελικοειδές δεμάτιο, σχεδιάστηκαν νέα Rop μόρια ως δομικοί λίθοι ικανοί να αυτό-οργανωθούν σχηματίζοντας ινίδια. Επιλεγμένα ινίδια «διακοσμήθηκαν» με επιλεγμένα μεταλλάγματα της μεγανουκλεάσης I-CreI δημιουργώντας ινίδια, τα οποία φέρουν καταλυτικές ιδιότητες (διάσπαση δίκλωνου DNA με εξαιρετικά υψηλή εξειδίκευση ως προς την αλληλουχία αναγνώρισης) που αντιστοιχούν στην ενεργότητα του επιπρόσθετου ενζύμου. Επιπροσθέτως, δημιουργούν και νέες ιδιότητες, μη φυσικής εξειδίκευσης ως προς την αλληλουχία αναγνώρισης του DNA, μέσω της δημιουργίας ετεροδιμερών. Η ιδιότητα αυτή ανοίγει νέους ορίζοντες για εφαρμογή στη γονιδιακή θεραπεία.
Συνοψίζοντας, μέσω της λεπτομερούς κατανόησης της αναδίπλωσης ενός απλού δομικού προτύπου (4-α-helical bundle της Rop) δημιουργήθηκε ένας δομικός λίθος αποτελούμενος από μία ολόκληρη α-ελικοειδή πρωτεΐνη. Το καινοτόμο αυτό επίτευγμα προάγει την έρευνα των βιοϋλικών που βασίζονται σε α-έλικες, σε σχέση με τις υπάρχουσες τεχνολογίες. Ο τρόπος παραγωγής των βιοϋλικών, μέσω τεχνικών ανασυνδυασμένου DNA και υπερέκφρασης σε E.coli κύτταρα, προσδίδει το πλεονέκτημα του χαμηλού κόστους παραγωγής. Τέλος, η επιτυχημένη προσθήκη λειτουργικών ιδιοτήτων με την ενδονουκλεάση I-CreI είναι η απόδειξη επί της αρχής πως ο δομικός λίθος που βασίζεται στην πρωτεΐνη Rop, μπορεί να οδηγήσει σε ινίδια που φέρουν λειτουργικότητες με βιοτεχνολογικο/βιοϊατρικό ενδιαφέρον. Ταυτόχρονα, δημιουργήθηκαν τα εξαιρετικής σημασίας λειτουργικά ετεροδιμερή της ενδονουκλεάσης Ι-CreI βελτιώνοντας τις ιδιότητές της και διευρύνοντας τη χρήση της στη γονιδιακή θεραπεία.
(EL)
Development of novel biomaterials based on peptides and proteins, is a rapidly developing field of nanotechnology. A detailed and comprehensive understanding of protein folding would provide important information for the development of novel bio-inspired materials as the rational design of biomaterials can be developed through exploitation of the self-assembly properties of suitable protein-based scaffold.
In this PhD thesis, the elucidation of the protein folding of a 4-α-helical bundle protein is followed by the exploitation of the use this recurrent protein motif as building block for biomaterials. The small, homodimeric Rop protein that is a paradigm of a canonical 4-α-helical bundle, is used as a model to this research.
Approaching the folding problem of Rop, the first goal of this PhD research was to elucidate the role of the loops and structural intermediates in folding of Rop protein. Based on A31P, one of the extensively studied loop-mutants of Rop with drastic structural and physicochemical changes, three new mutants, with proline and glycine residues in the loop region were produced. Their structure and biophysical properties were studied confirming the role of turn residues in folding pathways and indicating that the effects of the loop region on a specific folding pathway are complex, being both sequence- and position- dependent.
The development of novel topologies and the extreme malleability of the Rop structure, demonstrated by the above studies, make this protein an attractive candidate for the development of novel biomaterials based on the 4-α-helix bundles which defines the second goal of this thesis. Based on RM6, a Rop mutant with a deletion of Rop residues, that is completely reorganized forming a homotetrameric bundle consisting almost entirely of straight α-helices with remarkable stability, two new Rop mutants have been produced that self-assemble to filament-like structure with nano- to micrometer features. The RM6-based bio-buildings block were, in addition, decorated with attachment of two selected mutants of the I-CreI meganuclease producing fibers that not only retain the activity of the attach endonuclease but also promote the creation of I-CreI heterodimer, that exhibit new
vi
DNA specificities and creates a basis for the use of these molecules as tools for genome modifications and gene therapy.
Concluding, the results of the present PhD thesis, significantly contribute to the elucidation of the folding pathway of 4-α-helical bundles and to an improved capacity for rational development of protein based fibers. To our knowledge, Rop-based fibers represent the first functionalizable fibers based on a complete natural protein. The Rop-based scaffolds offer a novel class of biomaterials due to their easy and cheap production, remarkable stability, plasticity and potential functionalization.
(EN)
