Η DNA μεθυλίωση είναι απαραίτητη κατά την εμβρυική ανάπτυξη και εμπλέκεται σε διάφορες βιολογικές διαδικασίες. Η DNA μεθυλοτρανσφεράση DNMT1 διατηρεί το πρότυπο μεθυλίωσης του προγονικού κυττάρου στους απογόνους του κατά την διαδικασία της αντιγραφής. Μελέτες DNMT1 Knock out/down (KO/KD) είτε σε αιμοποιητικές σειρές είτε σε ποντίκια έδειξαν ότι η DNMT1 καθοδηγεί τα HSCs να διαφοροποιηθούν προς κύτταρα της μυελικής σειράς. Η DNMT1 εμπλέκεται στη σίγηση της γ-σφαιρίνης των ερυθροκυττάρων στο ενήλικο στάδιο μεθυλιώνοντας τον υποκινητή της γ-σφαιρίνης και αλληλεπιδρώντας με πρωτεΐνες (TR2/TR4, BCL11A). Σε δημοσίευση του εργαστηρίου μας δείξαμε ότι η DNMT1 αλληλεπιδρά με διάφορους αιμοποιητικούς μεταγραφικούς παράγοντες (GATA1, FOG-1, GFI-1b) που εμπλέκονται στη διαφοροποίηση των ερυθροκυττάρων, δημιουργώντας ένα κύριο πρωτεϊνικό σύμπλοκο αποτελούμενο από την DNMT1 και τους μεταγραφικούς παράγοντες ZBP89 και ZNF143, το οποίο υφίστατο και σε μη αιμοποιητικά κύτταρα και αλληλεπιδρά με διακριτά υποσύμπλοκα αιμοποιητικών παραγόντων στα ερυθροκύτταρα. Επιπλέον, το μικρό PCNA Binding domain (PBD) της DNMT1 είναι αναγκαίο και ικανό για την αλληλεπίδραση της DNMT1 με μεταγραφικούς παράγοντες. Περαιτέρω στοιχεία υποδεικνύουν ότι η DNMT1 λειτουργεί ως συγκαταστολέας με ZBP89 και GATA1 δρώντας σε άνωθεν ρυθμίστηκα στοιχεία των γονιδίων των κύριων αιμοποιητικών παραγόντων PU.1 και GATA1. Ακόμη DNMT1 KD σε MEL κύτταρα έδειξε μια ξεκάθαρη αδυναμία στην παύση του κυτταρικού κύκλου κατά την διαφοροποίηση των ερυθροκυττάρων εξαιτίας της έλλειψης καταστολής γονιδίων υπεύθυνα για τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Ο κύριος στόχος της συγκεκριμένης έρευνας είναι να διαλευκάνει περαιτέρω τον ρόλο της DNMT1 κατά την διαδικασία της διαφοροποίησης των ερυθροκυττάρων. Για τον σκοπό αυτό, προσπαθήσαμε να δημιουργήσουμε και να χαρακτηρίσουμε DNMT1 KO MEL κύτταρα. Επίσης, προσπαθήσαμε να εξακριβώσουμε περαιτέρω πρωτεϊνικούς παράγοντες με τους οποίους η DNMT1 αλληλεπιδρά ώστε να εντοπίσουμε τις λειτουργίες στις οποίες εμπλέκεται χρησιμοποιώντας μια μέθοδο, η οποία φέρει ως επίτοπο την βιοτίνη στο πρωτεϊνικό μόριο ενδιαφέροντος, συζευγμένη με φασματομετρία μάζας. Ένας ακόμα στόχος της συγκεκριμένης έρευνας είναι να εντοπίσουμε τους γονιδιακούς στόχους της DNMT1 οι οποίοι καταστέλλονται μέσω της δράσης ενός μηχανισμού εξαρτώμενου ή ανεξάρτητου της DNA μεθυλίωσης, δεδομένου ότι η DNMT1 είναι η κύρια μεθυλοτρανσφεράση που εκφράζεται στα ερυθροκύτταρα και τα χαμηλά επίπεδα μεθυλίωσης στο γονιδίωμα των ερυθροκυττάρων. Ακόμη, προσπαθήσαμε να διερευνήσουμε κατά πόσο το μικρό PCNA binding domain (PBD) της DNMT1 την καταστεί ικρίωμα για την προσέλκυση επιπρόσθετων κατασταλτικών παραγόντων που επάγουν την γονιδιακή σίγηση διεξάγοντας πειράματα επαναφοράς φαινοτύπου σε DNMT1 KO κύτταρα τα οποία διαμολύνονται μόνιμα με DNMT1 μεταλλάγματα απαλοιφής.
(EL)
DNA methylation is essential for embryonic development and in diverse biological processes. The DNA methyltransferase Dnmt1 maintains parental cell methylation patterns on daughter DNA strands in mitotic cells. DNMT1 knock out/down (KO/KD) studies in hematopoietic lineages or in mice revealed that DNMT1 drives HSCs to myeloerythroid fate. In adult-stage erythroid cells, DNMT1 represses γ-globin gene expression by methylating its promoter and interacts with proteins (TR2/TR4, BCL11A) implicated in the silencing of γ-globin expression. Publications of our laboratory showed that DNMT1 co-purified with several hematopoietic transcription factors (GATA1, FOG-1, GFI-1b) involved in erythroid differentiation forming a core complex composed by DNMT1 and transcription factors ZBP89 and ZNF143, present also in non-hematopoietic cells, which interacts with distinct hematopoietic protein subcomplexes. Additionally, a short PCNA Binding domain (PBD) of DNMT1 proved necessary and sufficient for DNMT1 interaction with these transcription factors. Further evidence suggested that DNMT1 functions as a co-repressor of ZBP-89 and GATA1 acting through upstream regulatory elements of major hematopoietic transcription factors, the PU.1 and GATA1 gene loci. Moreover, DNMT1 KD in murine erythroleukemic (MEL) cells showed a clear lack in cell cycle arrest in erythroid differentiation due to the lack of repression of genes responsible for cell proliferation. The main aim of this study is to elucidate more clearly the role of DNMT1 in erythroid cell differentiation. Towards this aim, we attempted to generate and characterize DNMT1 KO MEL cells. Furthermore, we tried to further identify the protein partners of DNMT1 and exert its function, utilizing a biotin-tagging approach coupled to mass spectrometry. Another aim of this study is to identify gene targets of DNMT1 that are suppressed by its regulatory control through a methylation dependent or independent mechanism along global DNA demethylated erythroid genome, taking into account that DNMT1 is the main DNA methyltransferase expressed throughout murine fetal liver derived erythroid differentiation. Moreover, we tried to investigate whether the short PCNA binding domain (PBD) of DNMT1 renders DNMT1 a scaffolding protein for the recruitment of additional repressive partners inducing gene silencing performing phenotypic rescue assays of DNMT1 KO cells by stably transfecting DNMT1 deletion mutants.
(EN)
