Διερεύνηση των μοριακών μηχανισμών της νευροπροστατευτικής δράσης των νευροστεροειδών και νευροπεπτιδίων: επίδραση στη έκφραση των αποπτωτικών παραγόντων

 
Το τεκμήριο παρέχεται από τον φορέα :
Πανεπιστήμιο Κρήτης
Αποθετήριο :
E-Locus Ιδρυματικό Καταθετήριο
δείτε την πρωτότυπη σελίδα τεκμηρίου
στον ιστότοπο του αποθετηρίου του φορέα για περισσότερες πληροφορίες και για να δείτε όλα τα ψηφιακά αρχεία του τεκμηρίου*
κοινοποιήστε το τεκμήριο




2005 (EL)
Διερεύνηση των μοριακών μηχανισμών της νευροπροστατευτικής δράσης των νευροστεροειδών και νευροπεπτιδίων: επίδραση στη έκφραση των αποπτωτικών παραγόντων

Charalampopoulos, Ioannis
Χαραλαμπόπουλος, Ιωάννης

Μαργιωρής, Ανδρέας
Παπαβασιλείου, Ευστάθιος
Γραβάνης, Αχιλλέας
Στυλιανοπούλου, Φωτεινή
Καστανάς, Ηλίας
Στουρνάρας, Χρήστος

Τα Νευροστεροειδή Διϋδροεπιανδροστερόνη (DHEA), Θειϊκή Διϋδροεπιανδροστερόνη (DHEAS) και Αλλοπρεγνανολόνη (Allopregnanolone, Allo) παράγονται από το Κεντρικό Νευρικό Σύστημα (ΚΝΣ) και τον φλοιό των Επινεφριδίων, και τα επίπεδά τους μειώνονται σταδιακά πρωϊούσης της ηλικίας. Η μείωση αυτή έχει συσχετισθεί με δυσλειτουργία και εκφύλιση του Νευρικού Ιστού, πιθανόν διότι αυτά τα στεροειδή δρουν προστατευτικά στα νευρικά κύτταρα έναντι πολλών τοξικών παραγόντων. Πράγματι, πειραματικά δεδομένα αναφέρουν πως τα στεροειδή αυτά προστατεύουν νευρώνες του ιπποκάμπου και του φλοιού από βλάβες λόγω ισχαιμικών επισοδίων ή υπερδιεγερσιμότητας. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήσαμε την προστατευτική δράση των τριών αυτών στεροειδών στον μυελό των επινεφριδίων, ένα σημαντικό τμήμα του Συμπαθητικού Νευρικού Συστήματος, και παρακείμενο ιστό της κύριας θέσης παραγωγής αυτών των στεροειδών στην περιφέρεια, τον φλοιό των επινεφριδίων. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν πως τα Νευροστεροειδή DHEA, DHEAS και Allo ασκούν αντι-αποπτωτική δράση στην επαγώμενη από στέρηση ορού/αυξητικών παραγόντων απόπτωση στα νευρογενούς προέλευσης χρωμιόφιλα κύτταρα επίμυος, αλλά και στην κυτταρική σειρά PC12, ένα καταξιωμένο μοντέλο μελέτης της κυτταρικής απόπτωσης κι επιβίωσης των νευρικών κυττάρων. Οι δράσεις των Νευροστεροειδών είναι χρόνο-και δόσο-εξαρτώμενες, με EC50 της τάξης του 1.8, 1.1 και 1.5 nM για τις DHEA, DHEAS και Allo αντίστοιχα. Η προ-επιβιωτική δράση τους φαίνεται ότι είναι ανεξάρτητη των NMDA, GABAA, Σίγμα-1 κι οιστρογονικών υποδοχέων κι εξαρτάται από τις αντι-αποπτωτικές πρωτεϊνες Bcl-2 διότι antisense ολιγονουκλεοτίδια κατά των πρωτεϊνών αυτών, ανέστειλλαν πλήρως τις αντι-αποπτωτικές δράσεις τους. Τα Νευροστεροειδή αυτά επίσης ενεργοποιούν τους προ-επιβιωτικούς μεταγραφικούς παράγοντες CREB και NF-κΒ, οι οποίοι αποτελούν ρυθμιστές της έκφρασης των γονιδίων Bcl-2. Επιπλέον, ενεργοποιούν την αντι-αποπτωτική κινάση PKCα/β, ένα μετα-μεταφραστικό ενεργοποιητή των πρωτεϊνών Bcl-2 και τέλος, επάγουν την φωσφορυλίωση-ενεργοποίηση δύο κύριων προ-επιβιωτικών μονοπατιών κινασών, τα PI3Κ-Akt και Src-MEK-ERK μονοπάτια. Δεδομένης της ανατομικής εγγύτητας της δικτυωτής ζώνης του φλοιού και του μυελού των επινεφριδίων, ελέγχθηκε επίσης η πιθανή παρακρινική δράση των Νευροστεροειδών στην παραγωγή και έκλυση των Κατεχολαμινών από τα συμπαθητικοαδρενεργικά κύτταρα χρησιμοποιώντας το μοντέλο των κυττάρων PC12. Οι DHEA, DHEAS και Allo αύξησαν ταχέως (σε 10 εως 30 λεπτά) και δοσο-εξαρτώμενα (EC50 στην τάξη των nM) τα επίπεδα των Κατεχολαμινών (Νορεπινεφρίνης και Ντοπαμίνης). Η τάχιστη δράση των στεροειδών στην έκλυση των Κατεχολαμινών επιτυγχάνεται μέσω του αποπολυμερισμού του υπομεμβρανικού δικτύου ακτίνης, ένα κυτταρικό σύστημα γρήγορης απόκρισης στην εξωκύττωση των εκκριτικών κοκκίων των Κατεχολαμινών. Η παρουσία ενός σταθεροποιητή του δικτύου ακτίνης, της Φαλασιδίνης, ανέστειλλε πλήρως την επαγώμενη από τα στεροειδή έκλυση των Κατεχολαμινών.Οι DHEAS και Αllo, κι όχι η DHEA, επίσης διέγειραν την σύνθεση των Κατεχολαμινών, αυξάνοντας τα επίπεδα των τελευταίων σε 24 ώρες, μια δράση που αναστέλλεται πλήρως παρουσία των αναστολέων της Υδροξυλάσης της Τυροσίνης, AMPT και Δεκαρβοξυλάσης των L-αρωματικών αμινοξέων, NSD1015. Οι DHEAS και Αllo επίσης αύξησαν τα επίπεδα mRNA και πρωτεϊνης της Υδροξυλάσης της Τυροσίνης, επιβεβαιώνοντας την υπόθεση ρύθμισης εκ των στεροειδών αυτών της σύνθεσης των Κατεχολαμινών. Η ακριβής φύση του υποδοχέα που διαμεσολαβεί τις ταχείες δράσεις των DHEA και DHEAS στα κύτταρα PC12 δεν έχει αποσαφηνιστεί. Οι αντι-αποπτωτικές δράσεις φαίνεται να είναι ανεξάρτητες των NMDA και GABA υποδοχέων, αφού τα κύτταρα PC12 δεν εκφράζουν λειτουργικές μορφές των υποδοχέων αυτών και δεν αποκρίνονται στους αγωνιστές τους. Η ταχεία κινητοποίηση των αντι-αποπτωτικών μηχανισμών της DHEA στα κύτταρα PC12 υποστηρίζει την υπόθεση πως το νευροστεροειδές αυτό ίσως χρησιμοποιεί ειδικές μεμβρανικές θέσεις. Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι η μη διαπερατή από την κυτταρική μεμβράνη DHEA-BSA διατηρεί την αντι-αποπτωτική δράση της ελεύθερης DHEA. Επιπλέον, πειράματα συνδέσης κορεσμού της [3Η]DHEA σε απομονωθείσες μεμβράνες κυττάρων PC12 αλλά και κυττάρων ιπποκάμπου επίμυος ή χρωμιόφιλων κυττάρων ανθρώπου έδειξαν την παρουσία ειδικών μεμβρανικών θέσεων πρόσδεσης της DHEA (KD της τάξης των nM). Οι μεμβρανικές αυτές θέσεις πρόσδεσης της DHEA είναι λειτουργικώς συζευγμένες με G-πρωτεϊνες, αφού η παρουσία της τοξίνης ΡΤΧ ανέστειλλε πλήρως την αντι-αποπτωτική δράση της DHEA-BSA. Σε αντίθεση με την μη πρόσδεση των Οιστρογόνων και της Προγεστερόνης, η Τεστοστερόνη και η Κορτικοστερόνη εκτόπισαν την προσδεδεμένη DHEA, δρώντας ως ανταγωνιστές αφού ανέστειλλαν την αντι-αποπτωτική δράση της DHEA, καθώς και την διεγερτική δράση της στην έκφραση των προ-επιβιωτικών πρωτεϊνών Βcl-2/Bcl-xL και της κινάσης Src. Tα αποτελέσματα αυτά προτείνουν ότι η DHEA πιθανόν ασκεί την νευροπροστατευτική της δράση μέσω ειδικών μεμβρανικών θέσεων, διαφορετικών των υποδοχέων NMDA, GABAΑ και Σίγμα- 1. Προς διερεύνηση των σχέσεων δομής-αντιαποπτωτικής δράσης της DHEA και της Allo, ελέγχθηκε η αντι-αποπτωτική τους δράση σε σύγκριση με μια σειρά δομικά συγγενών αναλόγων τους. Οι προ-επιβιωτικές δράσεις τους φαίνεται ότι απαιτούν συγκεκριμένες δομές, με την διαμόρφωση 3β-ΟΗ για τα ανδροστένια και την διαμόρφωση 3α-ΟΗ για τα πρεγνάνια να είναι δραστικές. Πράγματι, τα 3-κέτο, Δ4, ή C7-υδροξυλιωμένα ανάλογα ανδροστενίων και τα 3β παράγωγα πρεγνανίων δεν είχαν αντι-αποπτωτική δράση. Επιπροσθέτως, ένα συνθετικό ανάλογο (ΤC50) που ελέγχθηκε έδειξε ισχυρή αντι-αποπτωτική δράση στα συμπαθητικοαδρενεργικά κύτταρα με EC50 ίση με 0,087nM. Το μόριο TC50 προσδένεται με υψηλή χημική συγγένεια στην μεμβρανική θέση πρόσδεσης της DHEA (με KD της τάξης του pM), ενώ μιμείται και την επαγωγική δράση της DHEA στην έκφραση των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2. Εν κατακλείδι, τα αποτελέσματά μας προτείνουν πως τα Νευροστεροειδή όπως η DHEA, πιθανόν δρουν ως αντι-αποπτωτικοί, νευροπροστατευτικοί παράγοντες μέσω ειδικών μεμβρανικών θέσεων πρόσδεσης, και ρυθμίζοντας εν συνεχεία κύριες προ-επιβιωτικές κινάσες, καθώς και την έκφραση των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2. Τέλος, τα ευρήματά μας με το συνθετικό ανάλογο της DHEA, ΤC50, δείχνουν πως το στεροειδές αυτό ενδεχομένως να αποτελέσει ένα μόριο-οδηγό για την σύνθεση πρωτότυπων νευροπροστατευτικών χημικών ενώσεων, στερούμενων άλλων ενδοκρινών δράσεων. (EL)
The neuroactive steroids dehydroepiandrosterone (DHEA), its sulfate ester DHEA sulfate (DHEAS), and allopregnanolone (Allo) are produced by the CNS and the adrenals and their levels decrease gradually with advancing age. The decline of their levels was associated to neuronal dysfunction and degeneration, most probably because these steroids protect neurons against noxious agents. Indeed, experimental evidence suggest that they protect hippocampal and cortical neurons against ischemia- and excitotoxicity- induced injury. We have studied their protective role on the adrenal medulla, an important part of the sympathetic nervous system, and the tissue adjacent to their primary peripheral site of production. DHEA, DHEAS, and Allo protect rat neural-crest-derived chromaffin cells and the rat pheochromocytoma PC12 cell line, an established model for the study of adrenomedullary cell apoptosis and survival, against serum deprivation-induced apoptosis. Their effects are time- and dose-dependent, with EC50 1.8, 1.1, and 1.5 nM, respectively. The pro-survival effect of DHEA(S) and Allo appears to be NMDA-, GABAA-, sigma1-, or estrogen receptor- independent. It involves the antiapoptotic Bcl-2 proteins, their role being sine qua non for their action because Bcl-2 antisense oligonucleotides reverses their effects. DHEA(S) and Allo activate pro-survival transcription factors CREB and NF-κB, upstream effectors of anti-apoptotic Bcl-2 protein expression. They also activate the anti-apoptotic kinase PKCα/β, a post-translational activator of Bcl-2 protein and induce the phosphorylation-activation of two major pro-survival kinase pathways, PI3K-Akt and Src-ERK-MEK. Since zona reticularis and adrenal medulla are closely proximal with anatomically interwoven borders, we have also examined the possible paracrine effects of neurosteroids on catecholamine production from sympathoadrenal cells, using the PC12 cell model. DHEA, DHEAS, and Allo increase acutely (peak effect between 10–30 min) and dose-dependently (EC50 in the nM range) catecholamine levels (norepinephrine and dopamine). It appears that the acute effect of these steroids involve actin depolymerization/actin filament disassembly, a fast-response cellular system regulating trafficking of catecholamine vesicles. Specifically, 10-6 M phallacidin, an actin filament stabilizer, completely prevents steroid-induced catecholamine secretion. DHEAS and Allo, but not DHEA, also affect catecholamine synthesis. Indeed, DHEAS and Allo increase catecholamine levels at 24 h, an effect blocked by AMPT and NSD1015, inhibitors of tyrosine hydroxylase and L-aromatic amino acid decarboxylase, respectively, suggesting that this effect involved catecholamine synthesis. The latter hypothesis is supported by finding that DHEAS and Allo increase both the mRNA and protein levels of tyrosine hydroxylase. The exact nature of the receptor systems mediating these rapid actions of DHEA(S) on PC12 cells is unknown. These effects appear to be independent of NMDA or GABAA receptors since PC12 cells express negligible levels of non functional NMDA or GABAA receptors, and do not respond to their agonists. The rapid onset of DHEA and DHEAS actions on PC12 cells supports the hypothesis that these neuroactive steroids may utilize specific membrane receptors. Our findings show that non permeable DHEA-BSA maintains its ability to protect PC12 cells against apoptosis and suggest the presence of DHEA specific membrane binding sites (Kd in the nM range) on membranes isolated from PC12, human chromaffin and rat hippocampal cells. The putative membrane DHEA binding sites are functionally coupled to G-proteins, because Pertussis toxin totally blocks the anti-apoptotic effects of DHEA-BSA. In contrast to Estradiol and Progesterone, Testosterone and Corticosterone displace DHEA membrane binding, acting as antagonists by blocking the anti-apoptotic effect of DHEA-BSA, as well as its stimulatory effect on prosurvival Bcl-2/Bcl-xL proteins and Src kinase. These findings suggest that DHEA may exert neuroprotective effects via specific membrane binding sites, independent of NMDA or GABAA receptors. To investigate the structure-activity relationships of dehydroepiandrosterone (DHEA) and allopregnanolone (ALLO) as pro-survival factors, their anti-apoptotic effect was compared to that of a long list of structurally related compounds. Their pro-survival actions were found to be structure-specific, confined mainly to conformation 3β-OH-Δ5 for androstenes and 3α-OH for pregnanes. Indeed, 3-keto, Δ4, or C7 hydroxylated androstenes and 3β pregnanes were ineffective. Additionally, one of the synthetic analogs tested (TC50) was highly effective in protecting sympathoadrenal cells against apoptosis with an EC50: 0,087 nM, compared to DHEA (1 nM). TC50 binds with high affinity to recently described membrane DHEA binding sites (KD at picomolar concentration), and mimics DHEA in inducing pro-survival anti-apoptotic Bcl-2 proteins. In conclusion, our findings suggest that neurosteroids such as DHEA may act as anti-apoptotic, neuroprotective factors via membrane specific binding sites, downstream activating major pro-survival kinases (Src, MEK/ERK, PI3K/Akt) and production of anti-apoptotic Bcl-2 proteins. Finally, our findings with synthetic analogs suggest that TC50 might prove a lead molecule for the synthesis of novel neuroprotective compounds. (EN)

Τύπος Εργασίας--Διδακτορικές διατριβές
text

Cell Death
Neuropeptides
Neurodegenerative Diseases prevention and control

Πανεπιστήμιο Κρήτης (EL)
University of Crete (EN)

Ελληνική γλώσσα

2005-12-12
2006-11-23


Σχολή/Τμήμα--Ιατρική Σχολή--Τμήμα Ιατρικής--Διδακτορικές διατριβές



*Η εύρυθμη και αδιάλειπτη λειτουργία των διαδικτυακών διευθύνσεων των συλλογών (ψηφιακό αρχείο, καρτέλα τεκμηρίου στο αποθετήριο) είναι αποκλειστική ευθύνη των αντίστοιχων Φορέων περιεχομένου.