Ο νεκρωτικός κυτταρικός θάνατος ευθύνεται για την εκτεταμένη απώλεια κυττάρων
υπό ακραίες συνθήκες και συντελείται συνήθως κατά τη διάρκεια έντονων εκφυλιστικών
επεισοδίων, όπως τα εγκεφαλικά και οι ισχαιμίες, καθώς και σε νευροεκφυλιστικές
παθολογικές καταστάσεις του ανθρώπου (Martin, 2001; Syntichaki and Tavernarakis, 2002).
Ανάλογο πρότυπο κυτταρικού θανάτου είναι δυνατόν να επαχθεί στο νηματώδη
Caenorhabditis elegans λόγω υπερενεργοποίησης ιοντικών καναλιών ή χαμηλής
συγκέντρωσης οξυγόνου (Driscoll and Chalfie, 1991; Scott et al., 2002). Μελέτες τόσο σε
νηματώδεις όσο και σε θηλαστικά έχουν δείξει ότι η νεκρωτική καταστροφή των κυττάρων
πραγματοποιείται με τη συμμετοχή καλπαϊνών και πρωτεασών ασπαρτικού (Syntichaki and
Tavernarakis, 2002; Yoshida et al., 2002). Η μέγιστη ενεργότητα των τελευταίων
επιτυγχάνεται υπό όξινες συνθήκες (Goll et al., 2003; Ishidoh and Kominami, 2002). Ωστόσο,
οι παράγοντες που προκαλούν μη φυσιολογική και υπερβολική ενεργοποίηση αυτών των
ενζύμων κατά τη νέκρωση δεν είναι γνωστοί.
Δεδομένα που παρουσιάζονται στην παρούσα διατριβή υποδεικνύουν ότι η
λειτουργία των κυστιδιακών ΑΤΡασών πρωτονίων, που συμβάλλουν στην οξίνιση
ενδοσωμικών και λυσοσωμικών διαμερισμάτων του κυττάρου, απαιτείται για τη νέκρωση
στο νηματώδη C. elegans. Παρεμπόδιση της δραστηριότητάς τους κατέστειλε σημαντικά το
νεκρωτικό θάνατο. Τα επίπεδα νέκρωσης μειώθηκαν επίσης μετά από επώαση ζώων σε
διαλύματα ασθενών βάσεων, που προκαλούν αύξηση στο pH φυσιολογικά όξινων
ενδοκυτταρικών οργανιδίων. Η παρακολούθηση των μεταβολών του pH, με τη χρήση
μορφών της φθορίζουσας πρωτεΐνης GFP ευαίσθητων στις συνθήκες οξύτητας, αποκάλυψε
ότι συμβαίνει οξίνιση του κυτταροπλάσματος σε εκφυλιζόμενα κύτταρα υπό την προϋπόθεση
ότι εκφράζουν λειτουργικές κυστιδιακές ΑΤΡάσες. Η δυσλειτουργία αυτών ενίσχυσε
επιπλέον την καταστολή της νέκρωσης σε νηματώδεις με δυσλειτουργικές πρωτεάσες
ασπαρτικού. Δεν παρατηρήθηκε ωστόσο περαιτέρω αύξηση του κυτταρικού θανάτου σε ζώα
με μειωμένη ενεργότητα καλπαϊνών. Συμπερασματικά, το ενδοκυτταρικό pH παίζει
σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της νέκρωσης στο C. elegans. Προτείνεται ότι η δράση των
κυστιδιακών ΑΤΡασών απαιτείται για τη δημιουργία όξινων συνθηκών που προωθούν το
νεκρωτικό θάνατο, αυξάνοντας πιθανά την ενεργότητα εκτελεστικών πρωτεασών ασπαρτικού
στα εκφυλιζόμενα κύτταρα.
Ωστόσο, η αιτία της μείωσης του κυτταροπλασματικού pH κατά τη νέκρωση
παρέμεινε ασαφής. Μεταλλαγές σε γονίδια, που συμμετέχουν στη βιογένεση και τη
λειτουργικότητα των λυσοσωμάτων, επηρέασαν σημαντικά τα επίπεδα νεκρωτικού
εκφυλισμού. Παρακολούθηση της τύχης των λυσοσωμάτων κατά το νευροεκφυλισμό σε
ζωντανούς νηματώδεις, με τη χρήση ειδικών φθοριζόντων δεικτών, έδειξε ότι τα
λυσοσώματα συντήκονται και τοποθετούνται γύρω από το διογκωμένο πυρήνα των
νευρώνων. Σε πιο προχωρημένα στάδια η εκπομπή φθορισμού από λυσοσωμικές μεμβράνες
μειώθηκε, υποδηλώνοντας διάρρηξη των λυσοσωμάτων. Σε συνδυασμό με την επίδραση της
χορήγησης ασθενών βάσεων, το σύνολο των αποτελεσμάτων υποδεικνύει ότι τα λυσοσώματα
έχουν κυρίαρχο ρόλο στην καταστροφή των κυττάρων κατά τη νέκρωση και συμβάλλουν στη
μείωση του pH, απελευθερώνοντας το όξινο περιεχόμενό τους. Παρόμοιοι μηχανισμοί
συντελούν πιθανά και στο νεκρωτικό κυτταρικό θάνατο κατά τη διάρκεια εγκεφαλικών
επεισοδίων σε ανθρώπους, όπου η δημιουργία όξινων συνθηκών αποτελεί βασικό
χαρακτηριστικό.
Το λυσοσωμικό σύστημα συμμετέχει επίσης στην αποδόμηση ενδοκυτταρικών
πρωτεϊνών και οργανιδίων, που μεταφέρονται μέσω της αυτοφαγικής διαδικασίας.
Δυσλειτουργία της αυτοφαγίας, εξαιτίας απενεργοποίησης αυτοφαγικών γονιδίων ή
χορήγησης φαρμακευτικών αναστολέων, κατέστειλε τη νέκρωση, υποδηλώνοντας ότι η
αυτοφαγία απαιτείται για το νεκρωτικό θάνατο στο C. elegans. Επιπλέον, παρατηρήθηκε
υπερβολική αύξηση του αριθμού των αυτοφαγοσωμάτων σε πρώιμα στάδια
νευροεκφυλισμού, ενώ σε πιο προχωρημένα στάδια τα αυτοφαγοσώματα συγκεντρώθηκαν
στην περιφέρεια του πυρήνα των εκφυλιζόμενων νευρώνων, όπου εμφάνισαν μερικό ή ολικό
συνεντοπισμό με λυσοσώματα και μιτοχόνδρια. Διαπιστώθηκε επίσης ότι η επαγωγή της
αυτοφαγίας έπεται της ενεργοποίησης καλπαϊνών και συμμετέχει στην επιτέλεση του
κυτταρικού θανάτου σε συνεργασία με λυσοσωμικούς καταβολικούς μηχανισμούς.
Συμπερασματικά, η αυτοφαγία συντελεί στην καταστροφή των κυττάρων κατά τη νέκρωση
σε νηματώδεις. Κατά συνέπεια, η παρεμπόδισή της είναι πιθανό να προσφέρει προστασία
έναντι του νεκρωτικού θανάτου και στον άνθρωπο.
(EL)
Necrotic cell death underlies extensive neuronal loss in acute degenerative episodes,
such as ischemic stroke, and in devastating human pathologies, like neurodegenerative
diseases (Martin, 2001; Syntichaki and Tavernarakis, 2002). In the nematode Caenorhabditis
elegans, hyperactivation of specific ion channels or hypoxia evoke an analogous pattern of
neuronal death (Driscoll and Chalfie, 1991; Scott et al., 2002). Investigations in both
nematodes and mammals implicate specific calpains and aspartyl proteases in the execution
of necrotic cell death (Syntichaki and Tavernarakis, 2002; Yoshida et al., 2002). Aspartyl
proteases achieve full activity under acidic conditions (Goll et al., 2003; Ishidoh and
Kominami, 2002). However, the factors that induce aberrant activation of these otherwise
benign enzymes during necrosis have been largely unknown.
In this thesis we show that the function of the vacuolar H+-ATPase, a pump that
acidifies endosomal and lysosomal compartments, is essential for the execution of necrotic
cell death in the nematode Caenorhabditis elegans. Indeed, impairment of the vacuolar H+-
ATPase function or alkalization of normally acidic intracellular organelles by weak bases
protected against necrosis. The use of pH-sensitive green fluorescent protein (GFP)-
molecules revealed reduction of cytoplasmic pH in dying cells. Intracellular acidification
required the vacuolar H+-ATPase function. Suppression of necrosis by aspartyl protease but
not calpain deficiency was further enhanced by conditions that perturbed intracellular
acidification. Thus, intracellular pH is an important modulator of necrosis in C. elegans. We
propose that the vacuolar H+-ATPase activity is required to establish necrosis-promoting
acidic intracellular conditions that augment the function of executioner aspartyl proteases in
degenerating cells.
However, the origin of cytoplasmic acidification remained obscure. Mutations in
genes that affect lysosomal biogenesis and function had a significant impact on necrotic death
levels. By using a genetically encoded fluorescent marker to monitor lysosomal fate during
necrosis in vivo, we found that lysosomes fuse and localize around a swollen nucleus.
However, in advanced stages of cell death GFP–labeled lysosomal membranes faded,
indicating lysosomal rupture. In conjunction with the effect of endocytic oganelle alkalization
on necrotic death, the sum of our data suggests that lysosomes have a prominent role in
cellular destruction during necrosis and facilitate pH reduction by releasing their acidic
content. Similar mechanisms may contribute to necrotic cell death that follows extreme
acidosis—for example, during stroke—in humans.
The lysosomal system participates via the autophagic process to the degradation of
intracellular proteins and organelles. We checked the involvement of autophagy in necrosis
and found that it is required for necrotic death in C. elegans. Impairment of autophagy by
genetic inactivation of autophagy genes or by pharmacological treatment suppressed necrosis.
Excessive autophagosome formation was induced early during neurodegeneration. At more
pronounced stages autophagosomes accumulated in the nucleus periphery, where they
exhibited partial or complete colocalization with lysosomes and mitochondria. Autophagy
induction was preceded by calpain activation and synergized with lysosomal catabolic
mechanisms to facilitate cell death. These findings demonstrate that autophagy contributes to
cellular destruction during necrosis. Thus, interfering with the autophagic process may protect
neurons against necrotic damage in humans.
(EN)
