Α-Ι είναι σημαντική για την βιογένεση της λιποπρωτεϊνης υψηλής πυκνότητας (HDL) και προστατεύει από την αθηροσκλήρωση. Μεταλλάξεις στην αποΑ-Ι σχετίζονται με Η απολιποπρωτεϊνη χαμηλά επίπεδα HDL στο πλάσμα και προδιάθεση για αθηροσκλήρωση. Ο σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν να διερευνηθεί η σχέση δομής-λειτουργίας της αποΑ-Ι του ανθρώπου και ο ρόλος συγκεκριμένων αμινοξέων της αποΑ-Ι στην βιογένεση και την ωρίμανση της HDL. H διατριβή χωρίζεται σε δυο μέρη.
Μέρος Ι: Μεταλλαξιογένεση των αρνητικά φορτισμένων αμινοξέων στην περιοχή 89 με 99 της απολιποπρωτεϊνης Α-Ι επηρεάζει την ομοιόσταση των λιπιδίων και την ωρίμανση της HDL. (J Lipid Res. 2011 Jul;52(7):1363-72). Γονιδιακή μεταφορά σε ποντίκια με ανεπάρκεια της αποΑ-Ι (αποΑ-Ι-/-) έδειξε ότι η μετάλλαξη αποΑ-Ι[D89Α/Ε91Α/Ε92Α] αύξησε τα επίπεδα χοληστερόλης του πλάσματος και προκάλεσε σοβαρή υπερτριγλυκεριδεμία. Τα επίπεδα της HDL μειώθηκαν και περίπου 40% της αποΑ-Ι μετατοπίστηκε στη περιοχή της LDL/IDL. Το κλάσμα της HDL περιείχε ως επί το πλείστον σφαιρικά σωματιδία καθώς και μερικά δισκοϊδή και το πλάσμα περιείχε preβI και α4 υποπληθυσμούς της HDL. Η μεταλλαγμένη πρωτεΐνη είχε αυξημένη συγγένεια σε γαλακτώματα πλούσια σε τριγλυκερίδια. Τα επίπεδα λιπιδίων και λιποπρωτεϊνών καθώς και το προφίλ της HDL της αποΑ-Ι[Κ94Α/Κ96Α] ήταν παρόμοια αλλά όχι ίδια με αυτά της αποΑ-Ι αγρίου τύπου. Ταυτόχρονη έκφραση αποΑ-Ι[D89Α/Ε91Α/Ε92Α] και ανθρώπινης λιποπροτεϊνικής λιπάσης διόρθωσε την υπερτριγλυκεριδαιμία, διόρθωσε εν μέρει τους α1,2,3,4 υποπληθυσμούς της HDL, επανέφερε την αποΑ-Ι στις HDL2/HDL3 περιοχές, αλλά δεν απέτρεψε τον σχηματισμό δισκοϊδών σωματιδίων. Συμπερασματικά, τα αμινοξέα D89, Ε91 και Ε92 της αποΑ-Ι είναι σημαντικά για τα επίπεδα της χοληστερόλης στο πλασμα και την ομοιόσταση των τριγλυκεριδίων καθώς και για την ωρίμανση της HDL.
Μέρος ΙΙ: Συμβολή των αμινοξέων 218 εώς 226 του γονιδίου της απολιποπροτεϊνης Α-Ι στη βιογένεση της HDL. Γονιδιακή μεταφορά με χρήση αδενοϊών της αποΑ-Ι[L218A/L219A/V221A/L222A] σε αποΑ-Ι-/- ποντίκια οδήγησε σε σχεδόν αξαφάνιση της HDL, μείωση κατά περίπου 90% στα επίπεδα της χοληστερόλης και της αποΑ-Ι στο πλάσμα συγκριτικά με τα ποντίκια που εκφράζουν την αποΑ-Ι αγρίου τύπου καθώς και στο σχηματισμό preβ και α4-HDL σωματιδίων. Ανάλυση με ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων και με ηλεκτρονική μικροσκοπία έδειξαν ότι η μεταλλαγμένη αποΑ-Ι[L218A/L219A/V221A/L222A] μορφή δεν μπορεί να σχηματίσει HDL σωματίδια όταν εκφραστεί σε αποΑ-Ι-/- x αποΕ-/- ποντίκια.
Η μεταλλαγμένη αποΑ-Ι[E223A/K226A] μορφή είχε παρόμοια επίπεδα αποΑ-Ι στο πλάσμα και είχε παρόμοια αλλά όχι ταυτόσημα προφίλ λιπιδίων και λιποπρωτεϊνών με την αποΑ-Ι αγρίου τύπου. Συμπεραίνουμε ότι κρίσιμες αλλαγές στα υδρόφοβα αμινοξέα 218-222 του C-τερματικού άκρου της αποΑ-Ι επηρεάζουν σημαντικά τις αλληλεπιδράσεις της αποΑ-Ι με την ABCA1 ή/και την LCAT και αναστέλουν την βιογένεση της HDL.
Στα πλαίσια της παρούσης διατριβής, μελετήσαμε σε συνεργασία με άλλες ερευνητικές ομάδες τον ρόλο του καρβοξυτερματικού άκρου της αποΑ-Ι στην τρανσ-ενδοκύττωση της HDL από ενδοθηλιακά κύτταρα (J Biol Chem. 2011 Mar 11;286(10):7744-54), την αντιβακτηριδιακή δράση της αποΑ-Ι απέναντι στο βακτήριο the Yersinia enterocolitica ορότυπος 0:3 (manuscript in preparation) και ο ρόλος μεταλλάξεων στην αποΑ-Ι σε ασθενείς με αυξημένο κίνδυνο για καρδιοπάθεια στον πληθυσμό της Κοπεγχάγης (J Intern Med. 2011 Mar 28. doi: 10.1111 in press).
(EL)
Apolipoprotein A-I is a key protein for the biogenesis of High Density Lipoproteins and
protects from atherosclerosis. Mutations in apoA-I gene are associated with low HDL
levels and predisposition to atherosclerosis. The purpose of the present thesis was to
explore the structure-function relationship in human apoA-I and the role of specific
amino acid residues in HDL biogenesis and maturation. The thesis is organized in two
parts.
Part I: Alteration of Negatively Charged Residues in the 89 to 99 Domain of
ApoA-I Affects Lipid Homeostasis and the Maturation of HDL (J Lipid Res. 2011
Jul;52(7):1363-72). Adenovirus-mediated gene transfer in apoA-I-/- mice showed that an
apoA-I[D89A/E91A/E92A] mutant increased plasma cholesterol and caused severe
hypertriglyceridemia. HDL levels were reduced and approximately 40% of the apoA-I
was distributed in VLDL/IDL. The HDL consisted of mostly spherical and few discoidal
particles and contained preβ1 and α4-HDL subpopulations. The mutant protein had
increased affinity for triglyceride-rich emulsions. The lipid, lipoprotein and HDL profiles
of the apoA-I[K94A/K96A] mutant were similar, but not identical, to those of wild type
apoA-I. Co-expression of apoA-I[D89A/E91A/E92A] and human lipoprotein lipase
abolished hypertriglyceridemia, restored in part the α1,2,3,4 HDL subpopulations,
redistributed apoA-I in the HDL2/HDL3 regions, but did not prevent the formation of
discoidal HDL particles. We conclude that residues D89, E91 and E92 of apoA-I are
important for plasma cholesterol and triglyceride homeostasis as well as for the
maturation of HDL. The present and two previous studies raise the possibility that
xvii
mutations in apoA-I in the general population may alter the functions of apoA-I and HDL
and contribute to hypertriglyceridemia.
Part II: Contribution of the residues 218 to 226 of apoA-I in the biogenesis of
HDL. Adenovirus mediated gene transfer of an apoA-I [L218A/L219A/V221A/L222A]
mutant in apoA-I-/- mice resulted in decreased plasma cholesterol and apoA-I levels to
approximately 10 % as compared to WT control and generated preβ and α4-HDL
particles. The HDL cholesterol peak of the mutant protein was greatly diminished. When
expressed in double deficient mice for apoA-I and apoE the apoAI[
L218A/L219A/V221A/L222A] mutant failed to form HDL particles as determined by
2D gel electrophoresis and electron microscopy. The apoA-I[E223A/K226A] mutant had
similar plasma apoA-I levels and similar but not identical lipid and lipoprotein profiles
with WT apoA-I. Overall the findings suggest that crucial changes in the C-terminal 218-
222 hydrophobic residues of apoA-I impair seriously the functional interactions of apoAI
with ABCA1 and/or LCAT and inhibit biogenesis of HDL.
In the context of this thesis we also investigated, in collaboration with other
groups, the role of apoA-I C-terminus in endothelial transcytosis of HDL (J Biol Chem.
2011 Mar 11;286(10):7744-54), the bactericidal activity of apoA-I against Yersinia
enterocolitica serotypre O:3 (manuscript in preparation) and apoA-I mutations in
patients with increased risk of ischaemic heart disease and total mortality in the
population of Copenhagen (J Intern Med. 2011 Mar 28. doi: 10.1111 in press)
(EN)
