Ανάλυση μικρών μορίων RNA που ελέγχουν μετα-μεταγραφικά φαινόμενα ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης

This item is provided by the institution :

Repository :
E-Locus Institutional Repository
see the original item page
in the repository's web site and access all digital files if the item*

PhD thesis (EN)

2004 (EN)
Analysis of short RNAS that control gene expression post - trascriptionaly
Ανάλυση μικρών μορίων RNA που ελέγχουν μετα-μεταγραφικά φαινόμενα ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης

Μπούτλα, Αλεξάνδρα

Τσαγρή, Ευθυμία

Τα μετα-μεταγραφικά φαινόμενα ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης τα οποία ελέγχονται από μικρά RNA αποτελούν το βασικό θέμα της παρούσας διδακτορικής διατριβής. Τα μικρά RNA έχουν μέγεθος 21-25 νουκλεοτίδια, ενώ αναγνωρίζουν και αλληλεπιδρούν με το στόχο τους μέσω συμπληρωματικότητας των βάσεων. Τα μικρά παρεμβαλλόμενα RNA (small interfering RNA, siRNA) είναι τα καταλυτικά μόρια για τα φαινόμενα μετα-μεταγραφικής σίγησης (PTGS/RNAi). Παράγονται μετά από την πέψη δίκλωνων μορίων RNA (double starnd RNA, dsRNA) από πρωτεΐνες τύπου RNaseΙΙΙ, και καθοδηγούν το μηχανισμό αναγνώρισης και αποικοδόμησης των RNA που ρυθμίζουν. Τα μικρά RNA (miRNA) παρεμποδίζουν τη μετάφραση των mRNA που ρυθμίζουν μέσω πρόσδεσης τους στην 3΄ μη μεταφραζόμενη περιοχή. Αρχικά διερευνήσαμε την ικανότητα συνθετικών siRNA να επάγουν PTGS/RNAi σε έμβρυα ?ροσόφιλας, σε σύγκριση με μακριά dsRNA. Τα siRNA αποτελούνται από δύο συμπληρωματικές αλυσίδες, που η κάθε μία φέρει στο 5΄ άκρο μία φωσφορική ομάδα και έχουν δύο 3΄ προεξέχοντα νουκλεοτίδια. Τα συνθετικά siRNA είναι ικανά να επάγουν PTGS/RNAi με τρόπο όμοιο με αυτών των φυσικών. Συνθετικά siRNA που δεν φέρουν τη 5΄ φωσφορική ομάδα ή έχουν τυφλά άκρα εξακολουθούν να είναι λειτουργικά, αν και λιγότερο αποτελεσματικά από ένα τυπικό siRNA. Αλλαγές στην αλληλουχία των siRNA είχε μόνο μικρή επίπτωση στην ικανότητα τους να επάγουν PTGS/RNAi όπως και οι αλλαγές που επηρεάζουν τη δομή των νουκλεοτιδίων του 3΄ άκρου. Η PTGS/RNAi στα φυτά δεν περιορίζεται στα φυσικά όρια ενός κυττάρου αλλά μπορεί να μεταφερθεί διασυστηματικά σε ολόκληρο το φυτό. Η δυνατότητα της διασυστηματικής εξάπλωσης της PTGS/RNAi έχει παρατηρηθεί και στο νηματώδη Caenorhabditis elegans. Προκειμένου να μελετήσουμε το σήμα της διασυστηματικής μεταφοράς απομονώσαμε εκχυλίσματα RNA από φυτά Nicotiana benthamiana τα οποία παρουσίαζαν σίγηση του γονιδίου αναφοράς GFP. Τα εκχυλίσματα ενέθηκαν σε καινοραβδίτη που έφερε το γονίδιο της GFP και ελέγχθηκε η ικανότητα τους να επάγουν PTGS/RNAi. Από αυτή την ανάλυση προέκυψε ότι σίγηση στο καινοραβδίτη μπορούσε να προκαλέσει ένα μόριο RNA μεγέθους ~85 νουκλεοτιδίων. Μελέτες που είχαν γίνει στο εργαστήριο με το ιοειδές PSTVd είχαν αποδείξει την παρουσία ειδικών για το ιοειδές siRNA σε μολυσμένα φυτά τομάτας. Η παρατήρηση u945 αυτή προκαλεί έκπληξη δεδομένου του ότι το ιοειδές πολλαπλασιάζεται στον πυρήνα ενώ όλες οι πρωτεΐνες του μηχανισμού της PTGS/RNAi εντοπίζονται στο κυτταρόπλασμα. Προκειμένου να διευκρινίσουμε που συσσωρεύονται τα siRNA πραγματοποιήσαμε λεπτομερή υποκυτταρική κλασμάτωση φυτικών ιστών μολυσμένων με το ιοειδές. Ανακλύψαμε ότι τα siRNA ανιχνεύονται στο κυτταρόπλασμα χωρίς να μπορούμε να διευκρινίσουμε πλήρως το ρόλο τους σε σχέση με το ιοειδές. Τέλος ασχοληθήκαμε με τα miRNA. Αρχικά θέλαμε δούμε αν είναι δυνατόν να παρέμβουμε στην λειτουργία των miRNA ενύοντας σε έμβρυα ?ροσόφιλα ολιγονουκλεοτίδια DNA με συμπληρωματική αλληλουχία για ορισμένα miRNA. Η εισαγωγή των αντικωδικών ολιγονουκλεοτιδίων προκάλεσε την εμφάνιση αναπτυξιακών φαινοτύπων που σχετίζονταν με την λειτουργία των miR-2/13. Επιπλέον αναπτύξαμε μια πειραματική μεθοδολογία για την ανίχνευση mRNA των οποίων η μετάφραση ελέγχεται από miRNA. Με την εφαρμογή αυτής της μεθόδου χαρακτηρίσαμε ορισμένα mRNA τα οποία ρυθμίζονται από τα miRNA 2/13. (EL)
During my thesis I have studied various aspects of those forms of post-transcriptional gene regulation that are mediated by various classes of small RNAs. Small RNAs are usually 21-25 nt long and interfere with the mRNA transcript in a sequence specific manner. Short interfering RNAs (siRNAs) are the result of an RNaseIII like nuclease (Dicer) on dsRNA and are functional intermediates of the posttranscriptional gene silencing (PTGS)/RNA interference (RNAi) phenomena; they direct the degradation of their target RNA. Micro RNAs (miRNA) block the translation of an mRNA through binding at its 3΄UTR. My research activities concerning these two classes of small RNA and PTGS phenomena can be divided in several subtopics. At the beginning of my PhD studies we were interested in what kind of synthetic siRNAs can induce RNAi in Drosophila embryos and how do they compare in their efficiency with long dsRNA. SiRNAs are composed of two RNA strands each having a 5΄ phosphate that form a duplex with two 3΄ protruding nucleotides at each end. Chemically synthesized siRNAs are likewise able to induce RNAi in vivo. I have tested various forms of synthetic RNA cassettes including those that are devoid of a 5΄ phosphate or they have blunt ends, which were active, although at lower efficiency than a typical siRNA. I also found that introduction of point mutations in the center of the cassettes had only moderate effect on their silencing potential. Further I studied variations in the design of the 3΄ termini of synthetic siRNAs. Secondly, I was interested to study the signal that is responsible for the systemic silencing in plants where PTGS/RNAi is non-cell autonomous. This property is also found in nematodes. I therefore fractionated RNA extracts taken from a Nicotiana benthamiana plant systemically silenced for the green fluorescent protein (GFP). These RNAs were injected into a GFP transgenic Caenorhabditis elegans line and assayed for their silencing potential. In this way I could identify an RNA component ~85 nt, in length, which could induce silencing in the nematode. Related to the plant work, my laboratory had found that potato spindle tuber viroid RNA (PSTVd) generates siRNA. This is surprising, since the viroid replication cycle takes place in the nucleus where also its dsRNA intermediates are located, while most of the PTGS components are located in the cytoplasm. In order to clarify where the siRNA accumulate in the infected host cell, we isolated nuclei from tomato plants infected with the viroid. We found that siRNAs accumulate in the cytoplasm. At current it is not clear whether they have a function in suppressing viroid replication. Finally, I became interested in miRNAs. At first we wanted to see whether it is possible to inhibit miRNA function by providing an artificial antisense target. Therefore I injected miRNAspecific antisense DNA oligonucleotides into Drosophila embryos. Some of these oligonucleotides induced specific developmental defects. In order to identify potential target genes that are regulated by those miRNAs we developed an experimental method that makes use of the DNA antisense oligonucleotides in a PCR strategy. In this way I could identify several target genes that are most likely regulated miRNA 2 and 13. (EN)

Τύπος Εργασίας--Διδακτορικές διατριβές

Μετά - μεταγραφική σίγηση
RNA, Μικρά Παρεμβαλλόμενα
RNA, Μικρά
Γονιδιακή ρύθμιση
DNA, Ρυθμιστικά μη κωδικά



Σχολή/Τμήμα--Σχολή Θετικών και Τεχνολογικών Επιστημών--Τμήμα Βιολογίας--Διδακτορικές διατριβές

*Institutions are responsible for keeping their URLs functional (digital file, item page in repository site)