Development of mass spectrometric approaches for protein and selenium metabolites determination

 
Το τεκμήριο παρέχεται από τον φορέα :
Πανεπιστήμιο Κρήτης
Αποθετήριο :
E-Locus Ιδρυματικό Καταθετήριο
δείτε την πρωτότυπη σελίδα τεκμηρίου
στον ιστότοπο του αποθετηρίου του φορέα για περισσότερες πληροφορίες και για να δείτε όλα τα ψηφιακά αρχεία του τεκμηρίου*
κοινοποιήστε το τεκμήριο




2012 (EL)
Ανάπτυξη μεθόδων φασματομετρίας μάζας για τον προσδιορισμό πρωτεινών και μεταβολιτών σεληνίου
Development of mass spectrometric approaches for protein and selenium metabolites determination

Τσιριγωτάκη, Αλεξάνδρα Μανούσου

Περγαντής, Σπυρίδων

Ο τομέας της βιοανάλυσης, και ειδικότερα οι τομείς της πρωτεομικής και μεταβολομικής, απαιτούν σύγχρονες και δυναμικές αναλυτικές τεχνικές για τη μελέτη βιοχημικών φαινομένων και συστημάτων, για την εύρεση και παρακολούθηση κατάλληλων βιοδεικτών, καθώς και για την παρακολούθηση των επιπέδων σημαντικών βιομορίων σε βιολογικά υγρά και ιστούς, ακόμα και σε ιχνοποσότητες. Η δυναμική της φασματομετρίας μάζας στη μελέτη των συγκεκριμένων συστημάτων, παρέχοντας εξαιρετική ευαισθησία και ακρίβεια, δομικό, ποιοτικό και ποσοτικό χαρακτηρισμό, με την ελάχιστη κατανάλωση δείγματος, την καθιστά ως το πλέον ιδανικότερο βιοχημικό εργαλείο. Ως εκ τούτου, στα πλαίσια της δεδομένης μεταπτυχιακής διατριβής, εφαρμόστηκαν φασματομετρικές προσεγγίσεις για τον προσδιορισμό των κύριων μεταβολιτών του σεληνίου, καθώς και της γενικής πρωτεΐνης του ανθρώπινου ορού αίματος, της αλβουμίνης, η οποία περιέχει σεληνομεθειονίνη, σε βιολογικά υγρά. Και στις δύο δεδομένες ανεξάρτητες μελέτες, αναπτύχθηκαν και βελτιστοποιήθηκαν μεθοδολογίες υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης σε σύζευξη με διαδοχική φασματομετρία μοριακών μαζών, υπό την παρακολούθηση επιλεγμένων μεταβάσεων ιόντων (HPLC-MRM). Συγκεκριμένα, μία CX-RPLC-MRM μεθοδολογία εφαρμόστηκε για την ταυτοποίηση και τον ποσοτικό προσδιορισμό γνωστών μεταβολιτών του σεληνίου σε ανθρώπινο ορό αίματος και ούρα. Για την απόκτηση μίας γενικευμένης εικόνας του μεταβολικού προφίλ συγκεκριμένων ανόργανων και οργανικών ενώσεων του σεληνίου στον ανθρώπινο οργανισμό, πραγματοποιήθηκαν πειράματα χορήγησης εξωγενούς σεληνίου, μέσω συμπληρωμάτων διατροφής, σε εθελοντές. Το είδος και τα επίπεδα των συγκεντρώσεων μικρών μη πρωτεϊνικών ενώσεων του σεληνίου παρακολουθούνταν με την CX-RPLC-MRM μεθοδολογία στα βιολογικά υγρά των εθελοντών. Η ταυτοποίηση των ενώσεων του σεληνίου πραγματοποιήθηκε με εφαρμογή πολλαπλών ποιοτικών κριτηρίων για την αξιόπιστη ταυτοποίησή τους, ενώ για την ποσοτικοποίησή τους στα βιολογικά δείγματα χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της προσθήκης γνωστής ποσότητας πρότυπων ενώσεων. Στην περίπτωση του κύριου μεταβολίτη του σεληνίου, του σεληνοσακχάρου μέθυλο-2-ακετάμιδο-2-δεόξυ-1-Se-β-D-γαλακτοζαμίνη (SeGalNAc) χρησιμοποιήθηκε ισοτοπικά ιχνηθετημένο εσωτερικό πρότυπο για τον ακριβέστερο ποσοτικό προσδιορισμό του, δεδομένης της πολυπλοκότητας της μήτρας. Τα αποτελέσματα που λήφθηκαν επιβεβαιώθηκαν με φασματομετρία ατομικών μαζών (HPLC-ICP/MS) από εξωτερικούς συνεργάτες (κ. Καθηγητής K.A. Francesconi, Πανεπιστήμιο Γκρατς, Αυστρία). Η παρακολούθηση των επιπέδων του σεληνίου στον ανθρώπινο οργανισμό καθίσταται αναγκαία, καθώς ο διαχωρισμός μεταξύ της ευεργετικής και της τοξικής δράσης του στοιχείου αυτού στον άνθρωπο είναι αρκετά στενός. Επιπλέον, ο μεταβολισμός του σεληνίου δεν έχει, ακόμα, αποσαφηνιστεί πλήρως, και επομένως, τα δεδομένα που λαμβάνονται από μελέτες όπως η συγκεκριμένη της παρούσας διατριβής, συνεισφέρουν στην κατανόηση αυτού. Ειδικότερα, μέσω της δεδομένης εργασίας, μελετήθηκαν για πρώτη φορά τα μεταβολικά προϊόντα της μέθυλο-σεληνοκυστεΐνης στον ανθρώπινο οργανισμό κατόπιν λήψης του αντίστοιχου συμπληρώματος διατροφής. Ο ορός αίματος αποτελεί το καταλληλότερο μέσο για την παρακολούθηση των επιπέδων του σεληνίου στον οργανισμό, καθώς αντανακλά άμεσα τις αλλαγές της κατάστασης του ιχνοστοιχείου που σχετίζονται με τη διατροφική του πρόσληψη αλλά και με διαταραχές στην υγεία. Όμως, η χαμηλή αφθονία των μικρών ενώσεων του σεληνίου στον ορό αίματος αλλά και η πολυπλοκότητα της μήτρας αυτού, αποτελούν πρόκληση από την αναλυτική σκοπιά. Η CX-RPLC-MRM μεθοδολογία που αναπτύχθηκε, ανταπεξήλθε στην ποσοτικοποίηση του κυρίαρχου μεταβολίτη του σεληνίου, του σεληνοσακχάρου SeGalNAc, στον ορό αίματος, αποτελώντας την πρώτη μέθοδο φασματομετρίας μοριακών μαζών που χρησιμοποιήθηκε επιτυχώς για ενώσεις του σεληνίου σε ορό αίματος. Επίσης, αναπτύχθηκε μία bottom-up RPLC-MRM μεθοδολογία για την ταυτοποίηση και τη label-free ποσοτικοποίηση της αλβουμίνης του ανθρώπινου ορού αίματος, με επίτευξη ικανοποιητικά χαμηλών ορίων ανίχνευσης, μέσω παρακολούθησης χαρακτηριστικών πεπτιδίων της συγκεκριμένης πρωτεΐνης. Η αλβουμίνη του ορού αίματος (HSA) αποτελεί μία υψηλής αφθονίας πρωτεΐνη, αντιπροσωπεύοντας το 60 % του συνόλου των πρωτεϊνών στο αίμα, και θεωρείται βιοδείκτης διαφόρων παθήσεων, όπως η οξεία νεφρική βλάβη. Όμως, παρουσιάζει σημαντική μικροετερογένεια, κυρίως μέσω της γλυκοζυλίωσης και της οξείδωσής της, με τα φαινόμενα αυτά να ενισχύονται σε παθολογικές καταστάσεις, όπως σε ασθενείς με διαβήτη. Η αδυναμία των εφαρμοζόμενων τεχνικών που χρησιμοποιούνται σε αναλύσεις ρουτίνας για τον ακριβή ποσοτικό προσδιορισμό της αλβουμίνης, όταν αυτή εμφανίζει αυξημένη μικροετερογένεια, αποτέλεσαν το κίνητρο της δεδομένης μελέτης, κατά την οποία πραγματοποιήθηκαν προσπάθειες για την ανάπτυξη μίας bottom-up RPLC-MRM μεθοδολογίας με υψηλή ανεκτικότητα στη βιολογική μεταβλητότητα. Τέλος, η αλβουμίνη ενσωματώνει στην πολυπεπτιδική της αλυσίδα σεληνομεθειονίνη, μέσω της τυχαίας και μη ελεγχόμενης αντικατάστασης ορισμένων καταλοίπων μεθειονίνης της πρωτεΐνης από σεληνομεθειονίνη. Στα πλαίσια μίας προσπάθειας για την ανίχνευση του σεληνίου σε επίπεδο πεπτιδίων, εγγενής ορός αίματος αναλύθηκε μέσω nRPLC-SIM παρακολούθησης των πεπτιδίων της αλβουμίνης που περιέχουν μεθειονίνη και των αντίστοιχων δυνητικών αναλόγων τους με σεληνομεθειονίνη. Σκοπός ήταν η συσχέτιση της αφθονίας των πεπτιδίων που περιέχουν μεθειονίνη και σεληνομεθειονίνη, για την πιθανή εύρεση κάποιου μηχανισμού της βιοχημικής κατανομής του σεληνίου στην αλβουμίνη. (EL)
The challenging task of bioanalysis, especially in the field of proteomics and metabolomics, demands highly sensitive and state-of-the-art approaches for the investigation of biochemical systems and phenomena, as well as for the determination of the levels of biochemically significant biomolecules, such as biomarkers. It is currently widely accepted that mass spectrometry is an ideal biochemical analysis tool, due to its unparalleled characteristics, such as the sensitivity and accuracy, in addition to its capability to supply structural, qualitative and quantitative information. Hence, the determination of the main metabolites of selenium, as well as of the general protein human serum albumin (HSA) in biological fluids, which constituted the objective of this MSc thesis, was conducted through mass spectrometric analysis. Methodologies based on high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry, in multiple reaction monitoring mode (HPLC-MRM), were developed and optimized both for the selenium metabolites and the human serum albumin, independently. In fact, a CX-RPLC-MRM assay was applied for the analysis of human serum and urine in order to identify and quantitate several known selenium metabolites. In terms of a general analysis of the metabolic profile of specific inorganic and organic selenium compounds in the human body, selenium ingestion experiments were conducted on volunteers. The concentration levels of eight small non-protein selenium compounds related to this essential trace element’s metabolism were monitored in the volunteers’ biological fluids by the CXRPLC-MRM assay. Due to the highly complex matrix of the biological fluids, the method of standard additions was chosen as the quantitative approach, while the quantitative determination of the main selenium metabolite methyl-2-acetamide-2-deoxy-1-β-D-galactosamine (SeGalNAc) was further enhanced by the use of an isotopically labeled internal standard. The narrow gap between selenium essentiality and toxicity dictates the importance of monitoring the concentration levels of selenium in the human body. In addition, since selenium metabolism is not yet totally clarified, analytical approaches such as the one developed in this thesis, significantly contribute to the general understanding of selenium metabolic pathways. For instance, the identification of methyl-selenocysteine’s metabolic products in humans, following MeSeCys ingestion through dietary supplements, was first conducted in this thesis. Moreover, while serum is the most accessible bioindicator for selenium levels, as it responds rapidly to changes in selenium status correlated with its dietary intake or physiological disorders, the determination of small selenium compounds in serum is a challenging analytical task, due to the combination of their low abundance in it and the complexity of serum matrices. Surprisingly, the CX-RPLC-MRM assay developed herein is the first molecular mass spectrometric method successfully applied on serum for the identification of selenium metabolites and the quantification of the main selenium metabolite, SeGalNAc. The identification of small selenium species by the CX-RPLC-MRM assay was evaluated by HPLC-ICP/MS analysis, conducted by external collaborators (Prof. Kevin A. Francesconi, University of Graz, Austria). A bottom-up RPLC-MRM assay was developed for the identification and the simplified labelfree quantification of human serum albumin, achieving satisfactorily low limits of detection, as well. HSA is the most abundant serum protein, constituting approximately 60 % of total blood proteins, and has been suggested to be a suitable biomarker for disorders, such as acute renal failure. It depicts significant micro-heterogeneity, mainly due its non-enzymatic glycosylation and oxidation. Such phenomena are enhanced in cirrhotics and diabetics. The inability of conventional routine approaches to quantitatively determinate microheterogenous isoforms of HSA triggered us to develop a bottom-up RPLC-MRM method robust enough as regards the biological variability. The efforts on this approach are featured in this thesis. Finally, human serum albumin, as a general serum protein, is believed to randomly incorporate selenomethionine in place of some methionine residues. A nano-RPLC-SIM approach was tested on human serum albumin’s methionine/selenomethionine peptides in order to detect the corresponding selenium on peptide level. The main target of the specific effort was to correlate the abundance of methionyl and selenomethionyl peptides, and to potentially discover a probable biochemical mechanism for the distribution of selenium in human serum albumin. (EN)

text
Τύπος Εργασίας--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης

Σεληνομεθειονυλικά πεπτίδια αλβουμίνης
Human serum albumin
Methylselenocysteine
Selenosugars
Label-free bottom up RPLC-MRM
Αλβουμίνη ανθρώπινου ορού αίματος
Sodium selenate
Φασματομετρία μάζας
Selenomethionyl peptides of albumin
Μεθυλο-σεληνοκυστεΐνη
Σεληνικό νάτριο
Selenium metabolism
Mass spectrometry
Σεληνοσάκχαρα
Μεταβολισμός σεληνίου

Πανεπιστήμιο Κρήτης (EL)
University of Crete (EN)

Ελληνική γλώσσα

2012-11-16


Σχολή/Τμήμα--Σχολή Θετικών και Τεχνολογικών Επιστημών--Τμήμα Χημείας--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης



*Η εύρυθμη και αδιάλειπτη λειτουργία των διαδικτυακών διευθύνσεων των συλλογών (ψηφιακό αρχείο, καρτέλα τεκμηρίου στο αποθετήριο) είναι αποκλειστική ευθύνη των αντίστοιχων Φορέων περιεχομένου.